Autore Bruno Pacifici

Uso di agenti chimici nel controllo della crescita microbica

La crescita dei microrganismi può essere controllata, oltre che con il calore, anche mediante l’uso di agenti chimici. Un agente antimicrobico è un composto chimico che uccide i microrganismi o ne inibisce la crescita e può essere sia un composto naturale che un composto chimico di sintesi. Spesso, per designare sostanze dotate di questo tipo di attività, si utilizzano parole composte dal nome del tipo di microrganismo che ne subisce l'azione e dal suffisso cida o statico, che indicano rispettivamente se il composto determini la morte o semplicemente inibisca la crescita del microrganismo. Quindi, un fungicida sarà un composto che provoca la morte di funghi, ma non necessariamente di batteri o alghe, mentre un batteriostatico sarà un composto che inibisce la crescita di batteri. ma non necessariamente di altri tipi di microrganismi.

La distinzione tra la capacità di un composto di determinare la morte o l'inibizione della crescita di microrganismi è spesso arbitraria, in quanto lo stesso composto può essere letale ad alte concentrazioni, mentre, a basse concentrazioni, può limitarsi ad avere effetto inibente. Per essere efficace, un agente inibente la crescita deve essere costantemente presente,poiché, se viene rimosso o neutralizzato, il microrganismo che ne subisce l'azione potrebbe, se le condizioni sono favorevoli, ricominciare a crescere.

Gli agenti antimicrobici possono essere anche molto diversi tra di loro per quanto riguarda la loro tossicità selettiva. Alcuni sono poco selettivi e hanno effetti simili su tutti i tipi di cellule, altri sono molto più selettiví e possono, ad esempio. essere più tossici per i batteri che per i tessuti animalì. Agenti antimicrobici dotati di tossicità selettiva sono particolarmente utili come chemioterapici per il trattamento delle malattie infettive, in quanto possono essere usati per uccidere i microrganismi patogeni senza danneggiare l'ospite.

Tipi di agenti antimicrobici

Antisettici: agenti microbicidi inoffensivi a sufficienza per essere applicati sulla pelle e sulle mucose di membrane; esempi: quelli a base di mercurio, di nitrato d’argento, le soluzioni iodurate, gli alcool, i detergenti.

Disinfettanti: agenti che uccidono gli organismi , ma non necessariamente le loro spore. Non possono essere utilizzati sui tessuti viventi; vengono usati su tavoli, pavimenti,utensili, ecc.. Esempi: cloro, ipocloriti, composti del cloro, la liscivia, il solfato di rame, composti d’ammonio quaternario.

Nota: disinfettanti e antisettici vengono distinti sulla base del fatto che possono essere o no usati per applicazioni sulle mucose delle membrane. Spesso, la sicurezza sta anche nella concentrazione del prodotto. Per esempio, l’ipoclorito di sodio (cloro), quando viene usato nell’acqua la disinfetta, ma il "chlorox" , un eccellente dsinfettante, è pericoloso da ingerire se aggiunto all’acqua.

Tabella2. Comuni antisettici e disinfettanti

Chemical	Action	Uses
Ethanol (50-70%)	Denatures proteins and solubilizes lipids	Antiseptic used on skin
Isopropanol (50-70%)	Denatures proteins and solubilizes lipids	Antiseptic used on skin
Formaldehyde (8%)	Reacts with NH2, SH and COOH groups	Disinfectant, kills endospores
Tincture of Iodine (2% I2 in 70% alcohol)	Inactivates proteins	Antiseptic used on skin
Chlorine (Cl2) gas	Forms hypochlorous acid (HClO), a strong oxidizing agent	Disinfect drinking water; general disinfectant
Silver nitrate (AgNO3)	Precipitates proteins	General antiseptic and used in the eyes of newborns
Mercuric chloride	Inactivates proteins by reacting with sulfide groups	Disinfectant, although occasionally used as an antiseptic on skin
Detergents (e.g. quaternary ammonium compounds)	Disrupts cell membranes	Skin antiseptics and disinfectants
Phenolic compounds(e.g. carboloic acid, lysol, hexylresorcinol, hexachlorophene)	Denature proteins and disrupt cell membranes	Antiseptics at low concentrations; disinfectants at high concentrations
Ethylene oxide gas	Alkylating agent	Disinfectant used to sterilize heat-sensitive objects such as rubber and plastics

---

Conservanti: inibiscono la crescita dei microrganismi, soprattutto nei cibi. Se ingeriti dovrebbero essere non tossici. Esempi: propionato di calcio, benzoato di sodio, la formaldeide, il nitrato, il diossido di zolfo.

Tabella 3. Conservanti per gli alimenti comuni e i loro usi

Preservative	Effective Concentration	Uses
Propionic acid and propionates	0.32%	Antifungal agent in breads, cake, Swiss cheeses
Sorbic acid and sorbates	0.2%	Antifungal agent in cheeses, jellies, syrups, cakes
Benzoic acid and benzoates	0.1%	Antifungal agent in margarine, cider, relishes, soft drinks
Sodium diacetate	0.32%	Antifungal agent in breads
Lactic acid	?	Antimicrobial agent in cheeses, buttermilk, yogurt and pickled foods
Sulfur dioxide, sulfites	200-300 ppm	Antimicrobial agent in dried fruits, grapes, molasses
Sodium nitrite	200 ppm	Antibacterial agent in cured meats, fish
Sodium chloride	?	Prevents microbial spoilage of meats, fish, etc.
Sugar	?	Prevents microbial spoilage of preserves, jams, syrups, jellies, etc.
Wood smoke	NA	Prevents microbial spoilage of meats, fish, etc.

Agenti chemioterapici: agenti antimicrobici di origine sintetica utili nel trattamento di malattie batteriche o virali. Esempi: la sulfanilammide, l’etanbutiolo, il cloramfenicolo. Nota che la definizione microbiologica di agente chemioterapeuta richiede che l’agente sia usato per scopi antimicrobici e quindi eslcude agenti sintetici usati per terapie contro malattie che non sono di origine microbica.

Antibiotici: agenti antimicrobici ,prodotti dai microrganismi, che uccidono o inibiscono la crescita di altri microrganismi. Questa è la definizione microbiologica. Una più ampia definizione di antibiotico include ogni composto chimico di origine naturale (da ogni tipo di cellula) che ha l’effetto di uccidere o inibire la crescita di altri tipi di cellule.

Che effetti hanno?

Gli agenti antimicrobici possono influire sulla crescita in diversi modi; gli studi sull'azione di questi composti in relazione alla curva di crescita aiutano a comprendere la loro modalità d'azione. Quando un agente antimicrobico viene somministrato a una coltura batterica in crescita esponenziale, è possibile osservare uno di tre tipi distinti di effetti: batteriostatico, battericida e batteriolitico.

Come è stato spiegato in precedenza, l'effetto di un batteriostatico è quello di inibire la crescita senza causare la morte del batterio (a). Spesso gli agenti batteriostatici sono inibitori della sintesi proteica e agiscono legandosi ai ribosomi. Si tratta, comunque, di legami piuttosto lassi, di modo che, quando la concentrazione dell'agente batteriostatico diminuisce, i ribosomi si staccano dall'inibitore e la crescita può riprendere.

Gli agenti battericidi provocano la morte delle cellule pur senza causarne la lisi (b). Generalmente i battericidi si legano al loro bersagli cellulari con legami irreversibili e non vengono rimossi per diluizione.

Gli agenti batteriolitici determinano la morte della cellula provocandone la lisi, effetto che si riflette in una diminuzione del numero di cellule o della torbidità in seguito all'aggiunta del composto (c). Gli agenti batteriolitici comprendono alcuni antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare, come la penicillina, come pure agenti che danneggiano la membrana citoplasmatica.

Misura dell'attività antimicrobica

L'attivita` antimicrobica si misura determinando la più piccola concentrazione del composto in esame necessaria per inibire la crescita di un dato organismo (chiamato organismo test); tale concentrazione viene chiamata minima concentrazione inibente (MIC). Uno dei metodi per determinare la MIC consiste nell'allestire una serie di provette, ciascuna contenente il terreno di coltura e una diversa concentrazione dell'agente antimicrobico da saggiare. Tutte le provette vengono inoculate e, dopo l'incubazione, la provetta contenente la più bassa delle concentrazioni che inibiscono la crescita, facilmente riconoscibile per l'assenza di torbidità visibile del terreno colturale, è quella che contiene la minima concentrazione inibente del composto esaminato.

Questa tecnica, semplice ma efficace, è talvolta chiamata tecnica delle diluizioni scalari. La MIC di un dato composto non è una costante assoluta: essa viene, infatti, influenzata dalle caratteristiche del microrganismo usato nel saggio, dalle dimensioni dell'inoculo, dalla composizione del terreno colturale, dal tempo di incubazione e da altri parametri, quali temperatura, pH e aerazione. Se tutte le condizioni sono rigorosamente standardizzate, è possibile confrontare agenti antimicrobici diversi e determinare quale sia il più efficace contro un dato microrganismo o stabilire l'efficacia di un singolo composto nei confronti di microrganismi diversi. E’ necessario sottolineare che questo metodo non distingue tra un composto battericida e uno batteriostatico, in quanto il composto è presente nel mezzo colturale durante tutto il periodo di incubazione.

Un'altra procedura comunemente usata per studiare l'azione antimicrobica di un composto è il metodo per diffusione in terreno agarizzato (Figura). In questo caso, viene allestita una capsula Petri contenente terreno agarizzato in cui è stato inoculato il microrganismo test. La piastra viene inoculata versando una piccola quantità di terreno agarizzato fuso contenente il microrganismo su una base di terreno agarizzato già solidificato in modo che si formi uno stato superficiale sottile, oppure distribuendo con una spatola un`aliquota di una coltura del microrganismo sulla superficie del terreno agarizzato solidificato.

Quantità note dell'agente antimicrobico vengono adsorbite su un dischetto di carta da filtro depositato sulla superficie del terreno agarizzato. In questo modo, durante l'incubazione, il composto diffonde creando un gradiente di concentrazione: quanto più ci si allontana dal dischetto tanto minore sarà la sua concentrazione, fino al punto in cui si raggiungerà la MIC. Al di là di questo punto si avrà crescita confluente, mentre nella zona più vicina al dischetto non si osserverà crescita. La zona in cui non si è avuta crescita viene chiamata alone di inibizione, e il suo diametro, che può venire facilmente misurato, sarà proporzionale alla quantità di agente antimicrobico presente sul dischetto e alla sua efficacia nelle condizioni adottate.