Autore Bruno Pacifici

Principi di genetica molecolare

La struttura del materiale genetico

Il gene

Organizzazione molecolare dei cromosomi procariotici e virali

Caratteristiche strutturali dei cromosomi degli eucarioti

La replicazione

Gli elementi trasponibili

Il processo di trascrizione

Il processo di traduzione e la sintesi proteica

La regolazione della sintesi proteica

Il lac operon:un esempio di sistema inducibile

Il trp operon:un esempio di sistema reprimibile

Controllo positivo e negativo

Il regulone del maltosio: un sistema che coinvolge la regolazione positiva

La struttura del materiale genetico

Il DNA

In tutti gli organismi procariotici ed eucariotici ed in gran parte dei virus il materiale genetico è DNA , mentre in alcuni virus è RNA. La forma del materiale genetico cambia a seconda dell’organismo e del virus: nei procarioti e negli eucarioti il DNA è sempre a doppio filamento, mentre nei virus, a seconda della specie, il materiale genetico può essere DNA o RNA a singolo o doppio filamento.

L’analisi chimica ha rivelato che il DNA e l’RNA sono macromolecole composte da monomeri chiamati nucleotidi. Ogni nucleotide è composto da:

- uno zucchero a 5 atomi di carbonio (desossiribosio nel DNA e ribosio nell’RNA) al quale sono legati

- una di quattro basi azotate ed

- un gruppo fosfato.

Nel DNA le quattro basi azotate sono adenina, guanina, citosina e timina,

mentre nell’RNA le quattro basi sono adenina, guanina citosina ed uracile.

La timina e l’uracile differiscono soltanto per un gruppo metilico presente nella timina ed assente nell’ uracile.

Mediante analisi chimico-fisiche si è determinato che la molecola di DNA consta di due catene polinucleotidiche unite da legami idrogeno tra coppie di basi (A con T, C con G) a formare una doppia elica ( il modello a doppia elica venne proposto per primi da Watson e Crick).

Il diametro dell’elica è di 2 nm, ed

ogni giro completo dell’elica (3,4 nm) comprende 10 paia di basi: pertanto, ogni coppia di basi è ruotata di 36° rispetto a quella che la precede nella molecola.

Mediante analisi della diffrazione a raggi X sono stati dentificati diversi tipi di DNA a doppia elica. I tre tipi principali sono l’A-DNA ed il B-DNA, destrorsi, e lo Z-DNA, sinistrorso. La forma comunemente trovata nella cellula (quella analizzata da Watson e Crick) è il B-DNA, mentre l’A-DNA non esiste a livello cellulare. Lo Z-DNA potrebbe esistere nelle cellule per regioni di DNA particolarmente ricche in guanina e citosina. Il significato funzionale dello Z-DNA è sconosciuto. Infine il B-DNA in soluzione è una molecola flessibile, capace di andare incontro a cambiamenti di forma. É stato dimostrato che certe sequenze aumentano la capacità del B-DNA di piegarsi, così come una curvatura del DNA può essere il risultato del legame di proteine specifiche a sequenze specifiche.

Il gene

Gli acidi nucleici formano i geni, che presiedono al metabolismo della cellula, regolando la sintesi delle proteine, in particolare di quelle enzimatiche, e quindi, la possibilità che le reazioni chimiche all’interno della cellula avvengano o meno. Essi controllano anche i processi di divisione cellulare (vedi Mitosi; Meiosi) e, quindi, l’accrescimento dell’individuo. Le informazioni contenute negli acidi nucleici sono costituite dalla sequenza con cui sono disposte le basi azotate; tale sequenza, attraverso un codice genetico universale, viene interpretata dalla cellula come sequenza di amminoacidi e permette la sintesi delle proteine. Un gene può quindi essere definito come una entità che specifica la struttura di una singola catena polipeptidica.

Il Gene in genetica, corrisponde all’unità ereditaria degli organismi viventi (procarioti ed eucarioti), dei virus e dei prioni; esso controlla la presenza nell’individuo di un determinato carattere e ne permette la trasmissione ai discendenti. L’insieme dei geni di un organismo costituisce il suo genoma o patrimonio ereditario. La posizione che ciascun gene occupa su un cromosoma è detto locus; questo termine viene a volte utilizzato al posto di gene. Poiché il DNA è una molecola caratterizzata da una sequenza di basi azotate, le proprietà che distinguono ciascun gene sono determinate dalla disposizione delle basi azotate presenti nel tratto di DNA che forma quel gene. La struttura di un gene non è immutabile ma può modificarsi per effetto di fenomeni spontanei o attraverso procedimenti artificiali: tale modificazione prende il nome di mutazione (spontanea e indotta).

Organizzazione molecolare dei cromosomi procariotici e virali

I cromosomi degli organismi procarioti sono costituiti da molecole di DNA circolare, a doppia elica, associate a un certo numero di proteine. Il cromosoma è compattato entro la cellula mediante superavvolgimento dell’elica di DNA e formazione di domini ad ansa del DNA superavvolto.

Il cromosoma del batterio E.Coli è circolare ed è estesamente superavvolto – superavvolto negativamente, dando luogo ad una molecola molto compatta. La quantità ed il tipo del superavvolgimento è determinato dalle topoisomerasi. In questo batterio la II superavvolge negativamente e la I fa tornare nello stato rilassato.

Esistono proteine strutturali associate ai cromosomi dei batteri?

Il DNA di un E.Coli è organizzato ad anse. La spiegazione di questa struttura è che il DNA, che è una molecola acida (carica negativamente), è associato a proteine strutturali basiche (cariche positivamente). Due di queste proteine sono simili a due delle proteine strutturali istoniche associate al DNA degli eucarioti.

Qual’è quindi il modello di struttura del cromosoma batterico?

-Il cromosoma batterico ha circa 100 domini indipendenti.

-Ogni dominio è costituito da un ansa di circa 40.000 paia di basi di DNA superavvolto negativamente

-Le estremità di ogni dominio sono tenute ferme, probabilmente da proteine (non si sa come), in modo che lo stato superavvolto del DNA in un dominio non sia modificato da eventi che influenzino il superavvolgimento di altri domini. Queste proteine possono essere messe in relazione funzionale con le proteine non istoniche dell’impalcatura degli eucarioti.

C’è solo il cromosoma principale nelle cellule batteriche?

No, spesso c’è anche DNA plasmidico: circoletti di DNA a doppio filamento, molto più piccoli del DNA circolare. Questi plasmidi replicano in modo autonomo.

Come sono i cromosomi dei fagi T-pari?

In base ai risultati di mappatura genetica, i genetisti hanno concluso che le mappe genetiche dei fagi T2 e T4 sono circolari e che i cromosomi fagici hanno termine in punti diversi lungo le mappe circolari, con sovrapposizioni delle estremità. É stato proposto che il DNA fagico stesso sia una popolazione di cromosomi lineari tutti della stessa lunghezza, ma con estremità in punti diversi lungo il cerchio. La disposizione è definita permutazione circolare.

É stato anche dimostrato che ogni molecola di DNA di T2 e T4 ha la stessa sequenza nucleotidica alle due estremità della molecola (ridondanza terminale). Quando il fago inietta nell’ospite il proprio cromosoma questo viene replicato parecchie volte. Le varie copie si uniranno in un concatamero grazie alle estremità con ridondanza terminale. I concatameri stessi subiscono ripetuti cicli di replicazione. Il DNA viene così impacchettato col meccanismo a testa piena del fago. La lunghezza del DNA è infatti determinata dal volume della testa stessa. (poco più di un cromosoma riesce a entrare). Þ quel poco più corrisponde alla sequenza ridondante.

Esiste DNA a singola elica in qualche organismo?

Si, nel fago FC174 ed è anche circolare. Questo DNA presenta geni sovrapposti, geni all’interno di altri geni e sequenze spaziatrici.

Il cromosoma del fago l?

è un DNA a doppia elica, lineare e non associato a proteine strutturali. Ha le estremità complementari e infatti una volta iniettato nell’ospite diventa circolare. In questa forma viene integrato mediante crossing-over nel cromosoma principale dell’ospite. Verranno prodotti concatameri, poi tagliati e infilati nelle teste.

Caratteristiche strutturali dei cromosomi degli eucarioti

Una differenza fondamentale tra procarioti ed eucarioti risiede nel fatto che i procarioti hanno un singolo tipo di cromosoma, mentre la maggior parte degli eucarioti ha un numero diploide di cromosomi in quasi tutte le cellule somatiche.

Un insieme completo di tutti i cromosomi metafasici di una cellula è definito cariotipo.

Il cariotipo è specie-specifico.

É convenzione disporre i cromosomi in ordine secondo la dimensione e la posizione del centromero (metacentrico, submetacentrico, acrocentrico, telocentrico).

Una identificazione inequivocabile di ogni cromosoma del cariotipo deriva dalle tecniche di colorazione delle regioni cromosomiche: bandeggi.

· Q ® colorante quinacrina: le bande scure corrispondono alle zone ricche in A e T

· G ® col colorante Giemsa: le bande scure corrispondono alle zone ricche in A e T

· FISH ® ibridazione a fluorescenza in situ: si possono colorare sequenze specifiche.

Tradizionalmente le sonde venivano marcate con trizio, un isotopo radioattivo dell’idrogeno. Ora si usano sostanze chimiche diverse che possono essere impiegate nello stesso esperimento.

A che serve colorare i cromosomi?

-Per una analisi citogenetica

-Per disporre i punti di riferimento per la mappatura dei geni.

La quantità totale del genoma aploide di un individuo è detto valore C e la complessità di struttura dell’organismo.

La struttura del cromosoma eucariotico

È costituito da cromatina : complesso di DNA, proteine cromosomiche, RNA

Le proteine cromosomiche :

proteine istoniche – hanno una carica positiva che facilita il loro legame col DNA.

ci sono 5 tipi di istoni: H1, H2A, H2B, H3, H4. Le sequenze aminoacidiche indicano un elevato grado di conservazione tra specie filogeneticamente distanti.

Proteine non istoniche – alcune hanno un ruolo strutturale, alcuni sono enzimi e altre sono proteine

implicate nella replicazione e trascrizione.

Com’è impacchettato il DNA?

Esistono delle dimostrazioni che le anse corrispondono alle unità di replicazione dei cromosomi

Dai nucleofilamenti alle fibre di cromatina di 30 nm ai ripiegamenti di queste in domini ad ansa su impalcature non istoniche

- il livello più semplice di impacchettamento è il nucleosoma: DNA attorno agli istoni

organizzati ad ottamero.

L’H1 sigilla il nucleosoma.

Il DNA tra un nucleosoma e l’altro è detto linker

- lo stato più compattato implica un avvolgimento del complesso DNA istoni in anse di ordine superiore.

I centromeri

Da essi dipende il comportamento dei cromosomi alla mitosi ed alla meiosi. Se i centromeri non funzionano correttamente avviene una non-disgiunzione dei cromosomi. La regione del centromero contiene il cinetocoro al quale si attaccano le fibre del fuso durante la divisione. Per l’attacco dei mcrotubuli ad un centromero sono necessarie proteine che interagiscono col DNA centromerico.

I telomeri

Per impedire riarrangiamenti cromosomici non sono “appiccicosi” e sono spesso associati alla membrana nucleare.

Nei procarioti tutto il genoma è presente come DNA a sequenze uniche. Il genoma umano può essere descritto come costituito da :

-64% di DNA a sequenze uniche

-25% di DNA a sequenze moderatamente ripetute

-10% di DNA altamente ripetute

le sequenze altamente ripetute tendono ad essere localizzate nelle regioni eterocromatiche , ad esempio attorno ai centromeri e alle estremità dei cromosomi.

Le sequenze uniche e moderatamente ripetute tendono ad essere sparse.

La replicazione

Meccanismo di tipo: semiconservativo

(entrambe le eliche come stampo)

- Chi catalizza la reazione? Un enzima chiamato DNA polimerasi.

- In che modo opera quest’enzima? Aggiunge desossiribonucleosidi 5’trifosfati (dNTP) in direzione 5’-3’.

- In che modo iniziano la replicazione questi enzimi? La polimerasi inizia solo quando c’è l’innesco, in pratica una porzione di RNA chiamata primer.

- Chi è che catalizza la formazione del primer? Un enzima chiamato DNA primasi.

È un processo di tipo semidiscontinuo

(la sintesi di DNA su un filamento è continua ed è discontinua sull’altro)

- In che fase del ciclo cellulare avviene? Nella fase S (sintesi)

- A cosa è dovuta l’efficienza della replicazione negli eucarioti dove i cromosomi sono lunghi e numerosi? Al fatto che è iniziata in un gran numero di siti lungo i cromosomi.

Il complesso di proteine chiave con il DNA è detto macchina replicativa

- Cosa avviene durante la replicazione? Avviene la duplicazione del complemento istonico in modo che tutti i nucleosomi siano duplicati. Questo include: la sintesi di nuove proteine istoniche e l'assemblaggio di nuovi nucleosomi.

La nascita della bolla replicativa

Sequenza degli eventi che seguono l’apertura della bolla di replicazione nell’Escherichia Coli.

-Se sono noti quindi con certezza i ruoli delle polimerasi I (attività catalitica) e III (attività esonucleasica), non è però chiaro ancora il ruolo della polimerasi II.

-Le SSB sono proteine stabilizzatrici che legano il singolo filamento senza coprire le basi, in modo tale che quest’ultime possano essere ancora lette dalla DNA polimerasi III.

-Nelle cellule di mammifero sono state identificate cinque diverse polimerasi, chiamate a,b,g,d,e.

La a e la d sono responsabili della replicazione nel nucleo: funzionano essenzialmente come la III dell’Escherichia Coli. La b e la e servono per la riparazione del DNA danneggiato. La g catalizza la replicazione del DNA mitocondriale.

La replicazione delle estremità

- Chi sono le telomerasi? Sono enzimi specifici usati per replicare le estremità dei cromosomi negli eucarioti. Strutturalmente sono un complesso di RNA e proteine.

- Ad ogni replicazione infatti i cromosomi diventerebbero sempre più corti, perché il DNA nuovo all’estremità subisce la privazione del primer.

- Per evitare questo esistono sequenze ripetute in tandem nei telomeri che vengono riconosciute dalla telomerasi. Questa ripristinando una porzione di RNA che gli servirà da stampo catalizza la sintesi di tre nucleotidi di nuovo DNA sull’elica parentale. Poi si sposta verso la fine del cromosoma e continua la ripetizione completandola. Questo meccanismo lo ripete. In seguito ad opera della polimerasi sarà riempito lo spazio mancante sull’elica copiata facendo uso dell’RNA lasciato.

La sintesi degli istoni

Gli istoni quando vengono sintetizzati?

La trascrizione dei geni dei cinque istoni viene iniziata verso la fine della fase G₁, appena prima della Se la loro sintesi avviene nella fase S.

Il DNA si assembla in nucleosomi appena viene sintetizzato. Nonostante ciò, perché la replicazione proceda, i nucleosomi devono dissociarsi durante il breve tempo del passaggio della forca replicativa.

Come fanno?

Come segregano gli istoni nei nucleosomi da una generazione all’altra? Il modello suggerito è quello della segregazione semiconservativa.

Cos’è la ricombinazione genica e come avviene ?

- é una rottura e riunione di doppie eliche omologhe di DNA.

- Il modello di Holliday ne descrive il meccanismo. Questo modello prevede:

1. un preciso allineamento di sequenze di DNA omologhe di due doppie eliche parentali

2. un taglio endonucleolitico

3. l’invasione dell’altra elica da parte di ciascuna elica tagliata

4. la giunzione per produrre l’intermedio di Holliday

5. la migrazione del punto di ramificazione

6. il taglio e giunzione per risolvere l’intermedio di Holliday nelle doppie eliche ricombinanti

Come conseguenza dell’orientamento dell’evento di taglio, le risultanti doppie eliche saranno duplex pezzati o duplex ricombinanti , a seconda che i marcatori siano o no ancora sullo stesso cromosoma.

Fedeltà della replicazione del DNA: La correzione delle bozze.

Gli errori nella replicazione del DNA introducono mutazioni. Il tasso di mutazioni negli organismi viventi è notevolmente basso: tra 10^-8 e 10^-11 errori per coppia di basi inserita. Parte delle ragioni di questa accuratezza sta nel fatto che la DNA polimerasi inserisce le basi con la regola dell’appaiamento delle basi, A con T e G con C, usando il filamento stampo come modello. In aggiunta all’nserimento di nucleotidi nel filamento di replicazione, la DNA polimerasi svolge anche una attività esonucleasica 3’-5’, che può rimuovere un nucleotide inserito erroneamente e sostituitrlo con quello corretto.

L’attività esonucleasica di correzione di bozze è presente negli eucarioti, nei procarioti e nei sistemi di replicazione virale. In aggiunta alla capacità esonucleasica di correzione di bozze, procarioti ed eucarioti contengono proteine endonucleotidiche capaci di rimuovere un nucleotide male inserito molto tempo dopo che la polimerasi ha passato il punto di errore.

Gli elementi trasponibili

Questi sono pezzi di DNA che hanno la capacità di muoversi da un sito cromosomico ad un altro. Sono stati trovati nei procarioti e negli eucarioti e giocano un ruolo importante nella variazione genetica. Ci sono tre tipi di elementi trasponibili: sequenze di inserzione, trasposoni e alcuni virus particolari. Le sequenze di inserzione sono i tipi più semplici e non portano informazione genetica oltre a quella richiesta loro per muoversi in nuove collocazioni. I trasposoni sono più grandi e contengono altri geni. La caratteristica distintiva degli elementi trasponibili è che tutti si replicano come parte di altre molecole di DNA. Nonostante questo alcuni di questi elementi sono chiaramente autoreplicanti nel senso che controllano la propria replicazione e come tali si adattano alla nostra definizione di elementi genetici. Altri possono semplicemente essere considerati “geni mobili”.

La trascrizione

Processo mediante il quale sequenze di basi di DNA vengono copiate in sequenze di basi di RNA.

La catena di RNA viene sintetizzata in direzione 5' - 3', utilizzando un'elica soltanto del DNA. A regolare l'espressione di un gene, ci sono elementi genici regolativi, sequenze di coppie di basi associate al gene. La trascrizione è operata dall' RNA polimerasi .

Chi apre l'elica di DNA? - Nei procarioti è la RNA polimerasi stessa.

-Negli eucarioti lo srotolamento è opera di proteine specifiche che si legano nel punto di inizio della trascrizione.

L'elica che viene letta è quella 3'-5' e viene indicata come elica stampo.

A differenza della DNA polimerasi, la RNA polimerasi è capace di incominciare la sintesi di molte catene, ma non possiede la funzione di correzione di bozza.

Quante classi principali di trascritti si possono ottenere?

L’mRNA è l’unico che viene tradotto in polipeptidi e la sua traduzione avviene sui

associazione di proteine e 3 (nei procarioti) o 4 (negli eucarioti) molecole di RNA

Dal pre-RNA all’ RNA maturo:

Questo implica 1.modificazione delle basi

2.eliminazione delle sequenze non codificanti (introni)® richiesta solo negli eucarioti

Un gene che codifica per una molecola di mRNA,

e quindi per una proteina, viene detto gene strutturale.

Se gli RNA trascrivibili sono diversi, sono diverse anche le RNA polimerasi?

Nei batteri no, c’è un solo tipo di RNA polimerasi

Negli eucarioti si, ce ne sono tre tipi.

Le proprietà delle RNA polimerasi degli eucarioti:

RNA polimerasi	Localizzazione	Prodotti
I	Nucleolo	rRNA 28S,18S,5,8S
II	Nucleo	hnRNA,mRNA,alcuni snRNA
III	nucleo	tRNA,rRNA 5S e alcuni snRNA

La trascrizione dei geni strutturali

Un gene strutturale può essere schematizzato in tre porzioni: un promotore a monte, una sequenza codificante ed un terminatore a valle.

1.L’RNA polimerasi deve riconoscere il promotore. Per fare questo necessita di un polipeptide noto come fattore s. 2.Dopo il riconoscimento l’RNA polimerasi comincia ad aprire l’elica e a sintetizzare l’RNA. 3.Viene rilasciato il fattore sigma e mano a mano che la doppia elica di DNA si riforma viene rimosso l’RNA.

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	NOTA: Come nella replicazione anche nella trascrizione intervengono le topoisomerasi a facilitare lo svolgimento dell’elica.
Come fa ad arrestarsi il processo? I terminatori vengono suddivisi in quelli rho-dipendenti e quelli rho-indipendenti. In quest’ultimi viene fatto in modo che l’RNA neoformato formi una forcina. Questo è reso possibile dal fatto che è stata prodotta sull’RNA una sequenza autocomplementare. In quelli rho-dipendenti è necessaria la presenza del fattore rho, una proteina a due domini. Un dominio si lega prima all’ATP , l’altro dominio si lega poi all’RNA. A questo segue l’idrolisi dell’ATP che causa lo svolgimento dell’RNA dal DNA. Nei procarioti c’è una perfetta collinearità tra l’ordine delle coppie di basi nel gene e l’ordine delle basi corrispondenti nell’mRNA maturo.

all’RNA

Come fa a finire la trascrizione?

Non viene segnalata la fine e la trascrizione può continuare per centinaia o migliaia di basi oltre il punto chiamato sito di attacco del poly. Quando questo viene riconosciuto una RNA endonucleasi taglia l’RNA e viene aggiunta la coda ad opera della poly(A) polimerasi.

Negli eucarioti non c’è collinearità.

Dopo la loro produzione gli mRNA eucariotici vengono modificati ad entrambe le estremità:

Viene messo un cappuccio in 5’ con un insolito legame 5’-5’, in contrapposizione al consueto 5’-3’. Non c’è un DNA stampo per il cappuccio, poiché viene aggiunto da un enzima.

Qual è la funzione del cappuccio? Servirà per l’attacco del ribosoma all’estremità 5’ dell’mRNA.

All’estremità 3’ viene invece aggiunta una sequenza di 50-250 adenine detta coda poly (a). Non tutti gli mRNA ce l’hanno.

Che funzione ha la coda oltre a quella di segnalare la fine della molecola? Ha anche la funzione di dare stabilità alla molecola stessa. Molti mRNA eucariotici contengono delle sequenze che non codificano per nessun amminoacido, chiamate introni, che devono essere rimosse dal trascritto per formare una molecola di mRNA matura e funzionante, Le sequenze codificanti sono dette esoni. Come fanno gli introni ad essere rimossi? Nel pre-mRNA gli introni formano un occhiello, mediante l’intervento di snRNA, che viene eliminato in seguito al taglio operato da una nucleasi. Gli esoni adiacenti vengono legati insieme. Il processo è noto come “splicing”. Come fa il macchinario coinvolto a riconoscere l’introne? Sono dei segnali nucleotidici ad indicare il punto di giunzione tra l’uno e l’altro. Come si forma l’occhiello? Il taglio effettuato in 5’ fa si che l’estremità libera dell’introne si pieghi su se stessa fino ad unirsi ad una adenina (A), che fa parte di una sequenza chiamata sequenza del punto di ramificazione. Un ulteriore taglio nel sito di giunzione in 3’ determina l’excisione dell’introne. L’occhiello, identificato come RNA lariat viene successivamente trasformato in una molecola lineare e quindi degradato. Dove avviene questo processamento? Viene fatto solo nel nucleo in complessi specifici chiamati complessi di splicing fatti dal pre-mRNA legato alle snRNP.

La trascrizione dei geni per l’rRNA

A cosa serve l’rRNA?

Insieme alle proteine ribosomiali forma le due subunità di dimensioni ineguali che compongono i ribosomi. La loro funzione non è stata ancora completamente chiarita. In ogni caso è su di essi che avviene la sintesi proteica.

I ribosomi procariotici contengono 3 diverse molecole di rRNA. Come avviene la trascrizione dell’rRNA nei procarioti? Avviene nello stesso modo discusso nella trascrizione dei geni strutturali. In E.coli la produzione di quantità uguali dei tre rRNA è assicurata dalla trascrizione in un'unica molecola di rRNA precursore. È una unità trascrizionale (contenente i tre geni ad essere trascritta in un precursore 30S che contiene la sequenza leader in 5’, le sequenze 16S, 23S, 5S, ciascuna separata da sequenze spaziatrici, e la sequenza di coda in 3’. La p30S viene tagliata dalla RNasi III che produce tre molecole precursori. Queste si associano alle proteine ribosomiali.		I ribosomi citoplasmatici degli eucarioti sono più grandi e complessi di quelli dei procarioti e contengono 4 molecole diverse di rRNA. Come avviene la trascrizione dell’rRNA negli eucarioti? L’unica differenza rispetto alla trascrizione dell’mRNA e del tRNA è il procesamento che avviene con modalità diverse. Esistono un gran numero di geni per ognuno dei 4 tipi di rRNA. In questo caso parliamo di unità ripetuta di rDNA. Queste si trovano in corrispondenza dei nucleoli. Infatti gli rRNA ribosomiali vengono sintetizzati in corrispondenza di ciascun nucleolo. A questi si associano le proteine ribosomiali formando le subunità ribosomiali. Chi opera la trascrizione dell’rRNA? È la polimerasi I. Richiede dei segnali? Si, dei fattori trascrizionali specifici. Cosa separa un unità trascrizionale dall’altra? Le sequenze spaziatrici non trascritte (NTS), che contengono le sequenze promotore e terminatore. Una volta processato e unito alle proteine da come prodotto le subunità ribosomiali che escono dal nucleolo e migrano nel citoplasma.

La trascrizione dei geni per il tRNA

Ci sono 61 codoni diversi che possono essere usati in un mRNA per specificare l’aminoacido appropriato. In teoria ogni cellula potrebbe avere 61 tipi diversi di tRNA. In realtà per molto aminoacidi esistono più tRNA con l’appropriato anticodone.

Per poter codificare tutte le informazioni necessarie per la produzione di questo gran numero di tRNA, ci sono nel genoma numerosi geni per tRNA.

I tRNA sono prodotti come molecole di pre-tRNA che contengono una sequenza leader in 5’ e una sequenza in coda in 3’, entrambe eliminate per via enzimatica.

Alcuni pre-tRNA eucariotici hanno introni, che sono rimossi in fasi successive di processamento diverse da quelle caratteristiche dei pre-mRNA. Tutte le molecole di tRNA dopo la trascrizione vengono modificate chimicamente in modo considerevole. Le sequenze possono essere disposte in modo da assumere una conformazione secondo il modello a trifoglio del tRNA. L’appaiamento di basi infatti forma quattro strutture a stelo separate da quattro anse a singola elica.

L’ansa II contiene la sequenza detta anticodone che si appaierà a quella codone dell’ mRNA.

L’estremità 3’ è quella che si attaccherà all’ aminoacido.

Il processo di traduzione del codice genetico

Avendo a disposizione 4 nucleotidi diversi (A,C,G,U) un codice a tre lettere produce 64 possibili codoni.

Esistono però solo 20 aminoacidi. Questo suggerisce che alcuni aminoacidi vengano specificati da più di un codone.

Le caratteristiche del codice genetico sono le seguenti:

1. Il codice è a triplette.

2. Il codice non ha segni di interpunzione, ovvero è letto in modo continuo.

3. Il codice non ha sovrapposizioni.

4. Il codice è quasi universale.

5. Il codice è degenerato. Tranne due eccezioni, per ogni aminoacido è presente più di un codone.

6. Il codice ha segnali di inizio e segnali di fine. Dei 64 codoni possibili 61 soltanto codificano per aminoacidi. Questi sono detti codoni senso. Gli altri tre codoni – UAG, UAA, UGA – non specificano per nessun aminoacido e sono i codoni di stop detti anche non senso.

7. L’anticodone vacilla. Dal momento che 61 codoni specificano aminoacidi nel mRNA, esiste un totale di 61 molecole di tRNA che potrebbero portare gli anticodoni appropriati. A causa però del vacillamento nell’anticodone questi codoni potrebbero essere letti anche da meno tRNA. La base 5’ terminale all’anticodone (complementare alla base al 3’ terminale del codone) infatti, non è sottoposta a restrizioni come le altre due basi. Questa caratteristica permette un appaiamento meno preciso.

8. Il codice genetico è privo di ambiguità. È molto raro che un codone specifichi per più di un aminoacido: esempi di questo genere ci vengono dall’”effetto del contesto” dove la lettura del codone dipende dal contesto dove è inserito.

I tre stadi fondamentali della sintesi proteica sono - inizio, allungamento e termine – e sono simili nei procarioti e negli eucarioti.

INIZIO: Sia nei procarioti che negli eucarioti, la traduzione comincia al codone d’inizio AUG sull’mRNA, che codifica per metionina.

Negli eucarioti viene usato uno speciale tRNA.Met per l’inizio della traduzione ed una specie distinta di tRNA.Met per leggere i codoni AUG che si trovano in altri punti della molecola.

Non c’è nulla di simile alla sequenza di Shine-Dalgarno. Esiste un fattore d’inizio, un multimero di numerose proteine tra cui la cap binding protein che riconosce il cap all’estremità 5’ dell’mRNA e vi si lega. In seguito si lega un complesso formato dalla subunità ribosomale 40S con il Met-tRNA.Met ,

Questa sequenza a monte che permette l’allineamento è chiamata sequenza di Shine-Dalgarno. Es. in Escherichia Coli si ha la formazione di un complesso d’inizio 30S che richiede il riconoscimento da parte della subunità ribosomale della sequenza AUG. Questa subunità con dei fattori d’inizio e la GTP e l’attacco della fMet-tRNA.fmet porta al complesso d’inizio. Il successivo attacco della subunità 50S porta all’idrolisi del GTP e al rilascio dei fattori d’inizio. Il fMet-tRNA.fmet si lega all’mRNA al sito P del ribosoma 70S.

diversi fattori di inizio e GTP. Questo complesso migra lungo l’mRNA, alla ricerca del codone d’inizio AUG. Una volta trovatolo, la subunità 40S si lega ad esso, seguita dalla subunità 60S che spiazza i fattori d’inizio, a formare il complesso 80S. Il ribosoma 80S possiede un sito P ed un sito A, e il Met-tRNA.Met d’inizio si lega all’mRNA al sito P.

ALLUNGAMENTO:

1.Il tRNA si deve caricare e legare al ribosoma.

L’aminoacido si lega al 3’ terminale del tRNA mediante un legame tra il gruppo carbossilico dell’aminoacido ed il gruppo 3’OH o 2’OH del ribosio.

2. Si deve formare un legame peptidico.

Il primo passo consiste nella rottura del legame tra il gruppo carbossilico dell’aminoacido ed il tRNA nel sito P. In seguito interviene l’enzima peptidil transferasi che unisce i due aminoacidi.

3. Il ribosoma deve traslocare lungo l’mRNA, un codone alla volta.

Nei procarioti e negli eucarioti è necessario un fattore di allungamento.

Molti ribosomi possono tradurre in maniera simultanea lo stesso mRNA. Il complesso che si forma tra una molecola di mRNA e tutti i ribosomi che la stanno traducendo simultaneamente è chiamato poliribosoma.

LA TERMINAZIONE:

Il ribosoma è in grado di riconoscere i codoni di stop solo grazie all’aiuto di proteine dette fattori di terminazione, o fattori di rilascio.

La regolazione della sintesi proteica

Il modello dell’operone

All’interno della cellula vi sono meccanismi di regolazione che permettono di inibire o promuovere l’attività di un gene e, quindi, la sintesi proteica. Sarebbe così possibile distinguere geni ad azione strutturale, ossia effettivamente codificanti per corrispondenti proteine, e geni regolatori, che avrebbero una funzione di controllo su quelli strutturali. I due scienziati francesi François Jacob e Jacques Monod nel 1961 esposero il modello dell’operone , per spiegare le interazioni regolatrici fra geni, in particolare fra quelli coinvolti nella sintesi di enzimi necessari in una stessa catena di reazioni chimiche (o via metabolica).

In base a tale modello, i geni strutturali sarebbero vicini fra loro e legati a una sequenza di DNA detta promotore e a un’altra detta operatore, in modo da formare una struttura detta operone. Il promotore e l’operatore non codificano per alcuna proteina. Se il gene regolatore è inattivo, al promotore dell’operone si lega l’enzima RNA polimerasi, che determina la trascrizione dei geni strutturali e, quindi, la successiva sintesi delle proteine per cui essi codificano. Se il gene regolatore si attiva, produce mediante trascrizione un RNA messaggero dal quale si ottiene un repressore che va a legarsi all’operatore; ciò rende impossibile il funzionamento dell’RNA polimerasi legata al promotore; si blocca di conseguenza la sintesi delle proteine. Il gene regolatore può trovarsi anche distante dall’operone su cui esercita la sua azione; la sua inattività è dovuta al fatto che il repressore da esso prodotto viene bloccato da una molecola detta induttore.

Andiamo quindi a considerare due sistemi di controllo dell’espressione genica nell’Escherichia Coli. Entrambi i sistemi interessano la produzione di enzimi coinvolti nel metabolismo cellulare, ma ognuno in maniera diversa; vediamo come:

L’induzione: la produzione di uno specifico enzima ( o set di enzimi) in risposta alla presenza di un substrato (induttore).

Dovrebbe essere sottolineato che non tutti gli enzimi cellulari sono controllati da semplice induzione o repressione e che la sintesi di alcuni enzimi non è quasi controllata affatto. Gli enzimi costitutivi sono generalmente enzimi cellulari importanti richiesti per la crescita in tutte le condizioni nutrizionali e pertanto sono sintetizzati continuamente nella cellula in crescita.

La repressione: la cessazione della produzione di uno specifico enzima in risposta ad un incremento di livello del substrato (corepressore).

Tutti i geni che codificano per enzimi necessaria vie biochimiche si trovano uno a fianco all’altro sul cromosoma dell’E.coli. Una caratteristica chiave di entrambi i sistemi è che un singolo mRNA viene trascritto con multipli codoni di stop. Le proteine che vengono tradotte dall’RNA sono gli enzimi richiesti per una via biochimica. Questo tipo di mRNA è detto policistronico ed è unico dei procarioti.

L’operone lac: un sistema inducibile

Un esempio di sistema inducibile è costituito dall’operone del lattosio (operone lac) formato da tre geni che codificano per i tre enzimi che degradano il lattosio:

· b-galattosidasi= converte il lattosio in glucosio e galattosio

· permeasi=trasporta il lattosio nella cellula

· transacetilasi=funzione sconosciuta.

Quando nella cellula vi è un eccesso di questo zucchero, alcune sue molecole agiscono da induttori, cioè si legano al repressore prodotto dal gene regolatore e lo inattivano; in tal modo, può avvenire la sintesi degli enzimi che degradano il lattosio stesso, e quindi la concentrazione di tale zucchero nella cellula potrà scendere a valori normali.

Questa è l’animazione del processo di regolazione nell’operone Lac

Il processo illustrato

Gli studi su questo sistema sono stati possibili grazie alla presenza di mutanti costitutivi dell’E.Coli.

Un mutante costitutivo è uno nel quale il gene prodotto è prodotto continuamente, cioè non c’è più controllo. Così in questi mutanti, la mutazione deve essere su un gene che non sia tra quelli ad azione strutturale.

Geni nel Lac Operon	Funzione del gene
I	Gene per la proteina repressore
P	Promotore
O	Operatore
LacZ	Gene per la b-galattosidasi
LacA	Gene per la b-galattoside transacetilasi
LacY	Gene per la b-galattoside permeasi

Con le informazioni soprastanti possiamo predirre l’effetto che i vari mutanti avranno sull’espressione genica dell’operone lac.

Gene mutante nel Lac Operon	Fenotipo mutante
I	Espressione costitutiva perché l’operatore non sarà mai bloccato
P	Non si avrà espressione perché non si può legare l’RNA polimerasi
O	Espressione costitutiva perché non si legherà mai il repressore
LacZ	Non si avrà produzione di glucosio e galattosio
LacY	Non avverrà l’induzione perché il lattosio non viene trasportato all’interno della cellula

Il lattosio non è la fonte di carboidrati preferita dall’E.Coli. Se il lattosio ed il glucosio sono presenti, la cellula userà tutto il glucosio prima che il lac operon venga attivato. Questo tipo di controllo è detto repressione da catabolita. Per prevenire il metabolismo del lattosio esiste un secondo livello di controllo dell’espressione genica.

Il promotore dell’operone lac ha due siti di legame. Uno è dove si lega l’RNA polimerasi e l’altro è dove si lega il complesso CAP (catabolite activator protein) e AMP ciclico.

È questo il legame che deve essere presente per la trascrizione dell’operone.

La presenza di questo complesso è strettamente associata alla presenza di glucosio nella cellula perché meno glucosio c’è e più AMP ciclico si forma.

Il trp operon: un esempio di sistema reprimibile

Questo operone controlla la biosintesi di triptofano nella cellula a partire dal precursore iniziale, l’acido corismico. Questo operone contiene geni per la produzione di 5 proteine che vengono usate per produrre 3 enzimi. I prodotti dei geni E e D formano una proteina multimerica comprendente due copie di ogni proteina. L’enzima così formato è la antranilato sintetasi. L’enzima catalizza le prime due reazioni nella via metabolica del triptofano. L’altro enzima che catalizza gli altri due passaggi è la glicerofosfato sintetasi, multimero di due proteine che sono il prodotto dei geni B e A.

Al contrario dell’operone lac il gene per il repressore non è adiacente al promotore, ma localizzato in un’altra parte del genoma. Un’altra differenza è che l’operatore risiede interamente all’interno del promotore.

Geni del trp operon	Funzione del gene
P/O	Promotore;l’operatore si trova nel promotore
TrpL	Sequenza leader; la sequenza attenuatrice si trova al suo interno
TrpE	Gene per la subunità dell’antranilato sintetasi
TrpD	Gene per la subunità dell’antranilato sintetasi
TrpC	Gene per la glicerofosfato sintetasi
TrpB	Gene per la subunità della triptofano sintetasi
TrpA	Gene per la subunità della triptofano sintetasi

Come da schema della repressione, l’aumento di substrato porterà quest’ultimo a legarsi col repressore che impedirà la trascrizione dell’operone.

Come da tabella nella sequenza L leader c’è una sequenza attenuatrice. Questa sequenza ha 4 domini (1-4). Il dominio 3 (nucleotidi 108-121) dell’mRNA può appaiarsi sia col dominio 2 (nucleotidi 74-94) o 4 (nucletidi 126-134).

· Se il dominio 3 si appaia col 4, l’mRNA assume una forma a struttura a stelo e occhiello e la trascrizione si blocca. Questa struttura si forma quando il livello di triptofano è alto nella cellula.

· Se il dominio 3 si appaia col 2, la struttura di prima non si forma e la trascrizione continua. Questo avviene quando il livello di triptofano è basso.

Il dominio 4 è detto attenuatore perché la sua presenza è richiesta per attenuare la trascrizione del mRNA in presenza di alti livelli triptofano.

Anche il dominio 1 è un importante componente del processo di attenuazione. La sezione della sequenza leader codifica per un peptide (anch’esso detto leader) di 14 amminoacidi che ha due residui di triptofano.

Quando i livelli di triptofano sono alti sono alti anche i livelli di tRNA con triptofano. Immediatamente dopo la trascrizione l’mRNA si muove velocemente sul ribosoma e la traduzione è altrettanto veloce. Dopo aver tradotto rapidamente la sequenza leader procederà col resto dei geni e si avrà l’associazione del dominio 2 col ribosoma e quella dei domini 3 e 4 tra di loro con conseguente attenuazione della trascrizione .

Quando i livelli sono bassi questo non accade perché viene prodotto più lentamente il peptide derivante dalla lettura del dominio 1. A causa della lenta traduzione il dominio 2 non si associa al ribosoma ma col dominio 3. Questa ripiegatura non è però un segnale di terminazione perché consente infatti la trascrizione continuata dell’operone.

controllo positivo e negativo

Abbiamo visto fino ad ora esempi di controllo detto negativo (lac operon e trp operon) perché veniva effettuato tramite un repressore.

Esiste però anche un tipo di controllo positivo che viene effettuato tramite una proteina regolatrice attivatrice, che promuove il legame della RNA polimerasi incrementando la sintesi di mRNA.

Il regulone del maltosio: un sistema che coinvolge la regolazione positiva.

L’attivatore del maltosio non può legare il DNA a meno che la proteina non leghi prima il maltosio, l’effettore. La sequenza che serve da sito di legame dell’attivatore non è chiamato operatore ma sito di legame dell’attivatore.

Come funziona un attivatore? I promotori controllati positivamente hanno sequenze nucleotidiche che non sono simili a quelle della sequenza consenso tanto che l’RNA polimerasi anche con il corretto fattore sigma non riesce a riconoscerli. Questo sarà possibile solo dopo il legame dell’attivatore col DNA

I geni necessari per l’utilizzazione del maltosio sono presenti in diversi operoni, ognuno dei quali ha un sito di legame dell’attivatore a cui l’attivatore del maltosio può legarsi. Perciò l’attivatore del maltosio controlla più di un operone. Quando più di un operone è sotto il controllo primario della stessa proteina di regolazione, questi operoni sono collettivamente detti reguloni.

Si conoscono reguloni anche per operoni sotto controllo negativo. Gli enzimi della biosintesi dell’arginina sono codificati dal regulone dell’arginina, i cui operoni sono sotto il controllo del repressore dell’arginina.