Autore Bruno Pacifici

Misurare la crescita microbica

*        Teoria : conta totale, conta vitale, determinazione della massa cell.

*        Materiali

*        Procedura: per la conta totale diretta con campioni di liquido

per la conta vitale per piastramento in inclusione

 

Teoria

La crescita di una popolazione batterica viene misurata seguendo nel tempo la variazione del numero di cellule o della massa cellulare. Esistono parecchi metodi per contare il numero delle cellule o per stimare la massa cellulare; la scelta del metodo da utilizzare dipende dal tipo di microrganismo e dal problema che si intende affrontare.

 

Conta totale

Il numero di cellule di una popolazione può essere misurato contando le cellule al microscopio, un metodo chiamato conta diretta. Sono possibili due tipi di conta diretta: con campioni essiccati su un vetrino o con campioni in liquido. Con campioni in liquido devono venire usate delle speciali camere di conta. Nelle camere di conta (si usa il vetrino di Thomas-Zeiss o quello di Petroff-Hausser), sulla superficie del vetrino è inciso un reticolo quadrettato di cui è nota l'area di ogni riquadro (vedi figura).

Dato che lo spessore tra il reticolo e il vetrino coprioggetto è noto, è possibile conoscere il volume di sospensione batterica contenuta In ogni riquadro. Al microscopio, si conta il numero di cellule presenti in ogni riquadro del reticolo e questo valore viene convertito in numero di cellule per millilitro di sospensione semplicemente moltiplicandolo per un fattore di conversione basato sul volume della camera (Figura).

 

La conta diretta al microscopio è un modo rapido per stimare il numero di cellule ma presenta alcuni limiti:

(1)      Non è possibile distinguere le cellule vive dalle cellule morte.

(2)      E` difficile distinguere cellule di dimensioni molto piccole, pertanto un certo numero di cellule potrebbero non venire contate.

(3)    E` difficile ottenere stime precise.

(4)     Quando il campione non è stato colorato è necessario utilizzare un microscopio a contrasto di fase.

(5)     Il metodo è inadatto per sospensioni a bassa densità cellulare; se la sospensione contiene meno di 106 batteri per millilitro nel campo del microscopio si osserveranno pochissime cellule o addirittura nessuna.

 

Conta vitale

Nel metodo appena descritto si contano sia le cellule vive che le cellule morte. In alcuni casi si è invece interessati a contare solo le cellule vive; a questo scopo sono stati sviluppati i metodi per la conta vitale. Si definisce vitale (viable) una cellula capace di dividersi e dare progenie; il metodo usuale per ottenere una conta vitale consiste nel determinare il numero di cellule presenti In un campione capaci di formare colonie su un opportuno terreno agarizzato. Per questo motivo la conta vitale viene anche chiamata conta in piastra o conta delle colonie. Il presupposto di questo tipo di procedura è che ogni colonia sia originata da una singola cellula vitale.

 

 

Vi sono due metodi per attuare una conta in piastra: Il piastramento in superficie e il piastramento per inclusione (vedi Figura ). Nel piastramento in superficie, un volume noto di solito 0, 1 ml o meno, di una coltura opportunamente diluita viene distribuito sulla superficie di una piastra di terreno agarizzato con una spatola di vetro sterile. La piastra viene incubata fino alla comparsa delle colonie, che vengono quindi contate. E’ importante che la superficie della piastra sia piuttosto asciutta in modo che il liquido si adsorba. Solitamente si evita di usare volumi maggiori di 0, 1 ml per evitare che il liquido in eccesso non si adsorba e possa provocare la fusione di colonie diverse rendendo difficile il conteggio. Nel piastramento per inclusione (vedi Figura ), un volume noto (di solito 0,1‑1,0 ml) di coltura viene pipettato in una capsula petri sterile; viene poi aggiunto il terreno agarizzato fuso e il tutto viene mescolato facendo ruotare gentilmente la piastra sul piano del tavolo. Poiché il campione viene mescolato con il terreno agarizzato fuso è possibile utilizzare un volume maggiore di quello usato nel piastramento in superficie; tuttavia usando questo metodo è necessario essere certi che l'organismo che deve essere incluso nell'agar sia in grado di sopportare per breve tempo la temperatura dell'agar fuso, 45ºC.

In entrambe le tecniche è importante che il numero di colonie che si sviluppano su una piastra non sia troppo elevato, poiché un eccessivo affollamento Impedisce ad alcune cellule di formare colonie e il conteggio sarebbe quindi sottostimato. Inoltre è anche essenziale che il numero di colonie non sia troppo piccolo, altrimenti la significatività, statistica del numero di cellule così calcolato sarebbe troppo bassa. La pratica corrente, che è quella statisticamente più valida, consiste nel contare le colonie solo nelle piastre che contengono un numero di colonie compreso tra 30 e 300.

 

Per ottenere un numero di colonie appropriato per il conteggio, il campione che deve essere contato deve quasi sempre venire diluito. Poiché raramente si conosce in anticipo, anche approssimativamente, il numero delle cellule vitali, è solitamente necessario effettuare più di una diluizione. Comunemente, si utilizza una serie di diluizioni scalari in base dieci (Figura)

 

Per ottenere una diluizione di dieci volte (10‑1) si possono mescolare 0,5 ml di campione con 4,5 ml di diluente, oppure 1,0 ml di campione con 9 ml di diluente. Se è necessaria una diluizione di cento volte (10‑2), si possono mescolare 0,05 ml di campione con 4,95 ml di diluente, oppure 0, 1 ml di campione con 9,9 ml di diluente. Alternativamente, è possibile ottenere una diluizione per cento (10‑2) facendo due successive diluizione per dieci. Nella maggior parte dei casi è necessario effettuare diluizioni seriali di questo tipo per ottenere la diluizione finale desiderata. Per ottenere una diluizione 10-6 (1/10-6) si possono quindi fare tre diluizioni successive 10‑2 oppure sei diluizione successive 10‑1 .

 Per definire più chiaramente il tipo di risultato, la conta vitale viene spesso espressa come numero di unità formanti colonia (cfu, colony‑forming units) ottenute, piuttosto che come numero di cellule vitali (in quanto una unità formante colonia può essere costituita da una o più cellule).

 

Nonostante le imprecisioni intrinseche implicite di una conta vitale, questa tecnica permette di trarre, relativamente al numero di cellule vitali, le migliori informazioni possibili ed è quindi ampiamente utilizzata. Nella microbiologia alimentare, casearia, medica e delle acque, questa tecnica viene usata di routine. Il metodo ha il vantaggio di essere molto sensibile: dato che possono essere contati campioni contenenti pochissime cellule è possibile individuare anche una contaminazione microbica di piccola entità nei materiali in esame. Inoltre, utilizzando terreni colturali altamente selettivi è possibile contare solo particolari gruppi di microrganismi all'interno di una popolazione mista.

 

Determinazione della massa cellulare

In molti studi, è più conveniente stimare la massa delle cellule di una coltura piuttosto che il loro numero.

 

Peso secco. La massa netta può essere misurata centrifugando le cellule e pesando la massa cellulare privata del terreno. Il peso secco si misura disidratando la massa cellulare ottenuta per centrifugazione prima di pesarla; di solito la disidratazione viene ottenuta ponendo la massa cellulare In una stufa a 100‑105ºC per una notte. Generalmente il peso secco delle cellule batteriche si aggira Intorno al 10‑20% del peso umido della massa cellulare.

 

Colorimetria Un metodo semplice e molto utile per ottenere una stima relativa della massa cellulare consiste nell'effettuare misure di torbidità. Una sospensione cellulare appare torbida perché ogni cellula riflette la luce. Quanto maggiore è il numero di cellule presenti, tanto più la sospensione riflette la luce e tanto maggiore è la torbidità. La torbidità viene misurata con uno strumento chiamato colorimetro o con uno spettrofotometro. Con lo spettrofotometro la torbidità viene espressa come unità di assorbanza. Per gli organismi unicellulari l'assorbanza è (entro certi limiti) proporzionale sia al numero delle cellule che alla massa cellulare e quindi una determinazione della torbidità può essere usata in sostituzione del conteggio. Per ottenere il numero delle cellule partendo da una misura di torbidità, è necessario aver prima preparato una curva standard per ogni microrganismo studiato, che metta in relazione il numero di cellule (ottenuto per conta diretta al microscopio o per conta vitale) con la massa cellulare o con l'assorbanza. La torbidità è un modo di misurare la densità cellulare molto meno sensibile della conta vitale. ma ha il vantaggio di essere un metodo rapido, facile e che non danneggia o distrugge il campione. Questo tipo di misurazioni sono largamente utilizzate per seguire la crescita di una coltura in quanto lo stesso campione può essere misurato ripetutamente.

 

La misurazione della massa utilizzando un fascio di luce può essere quindi:

-nefelometrica: quantificazione della luce riflessa utilizzando nefelometri

-turbidimetrica: quantificazione della luce trasmessa utilizzando colorimetri (spettrofotometri).

 

Volume della massa cellulare. Si centrifuga un volume noto di sospensione microbica in provette tarate e si valuta poi il volume del sedimento. Il dato viene espresso come % rispetto al volume della sospensione

 

Determinazione dell’azoto. Si quantifica il contenuto di azoto della massa cellulare. L’azoto è uno dei componenti più rappresentativi della cellula ed il suo andamento è strettamente correlato allo sviluppo microbico. Viene molto usato nella microbiologia industriale ed in particolare nel caso di produzioni di biomasse microbiche.   

 

Attività metaboliche. Lo sviluppo microbico è sempre in relazione alla produzione e/o variazione di alcuni composti presenti nel terreno colturale o prodotti dal microrganismo stesso. Es. consumo dell’ossigeno disciolto nel substrato da parte di microrganismi aerobi; produzione di anidride carbonica da parte dei lieviti vinari.

Materiali

Per la conta totale diretta con campioni di liquido:

-vetrino con camere di conta

Per la conta vitale per piastramento in inclusione:

-6 provette contenenti 9 ml di acqua distillata

-almeno 7 pipette da 1ml

-100 ml di mezzo-agar fuso a circa 45°C

-6 capsule di Petri

 

Procedura

Per la conta totale diretta con campioni di liquido:

Si prende con una pipetta il campione di liquido contenente il microrganismo e lo si pone direttamente sul vetrino di Thoma-Ziss con camere di conta. Una singola camera di conta è un parallelepipedo che ha un altezza di 0,1mm , larghezza e profondità di 1mm.

 

il suo volume è diviso da 400 parallelepipedi più piccoli (quindi 20 per lato)

ed equivale a 0,1mm3/400 = 0,00025mm3 (1/4.000 di mm3 , 1/4.000.000 di cc)

 

Conto quante cellule trovo in ogni piccolo parallelepipedo per circa 250-300 di questi (al fine di avere un adeguata misura valida).

 

Supponiamo di aver contato 600 cellule in 300 piccoli volumi, qual’è allora la concentrazione della soluzione?

La concentrazione è data da questa formula: (n°cellule/n°piccoli volumi) · 4·106 ·fattore di diluizione

 

Il numero 4·106 deriva dal fatto che ogni piccolo parallelepipedo ha un volume di  1/4.000.000 di cc come visto prima.

 

per la conta vitale per piastramento in inclusione:

Al fine di ottenere un numero di colonie appropriato per il conteggio, il campione che deve essere contato deve quasi sempre venire diluito. Poiché raramente si conosce in anticipo, anche approssimativamente, il numero delle cellule vitali, è solitamente necessario effettuare più di una diluizione. Comunemente, si utilizza una serie di diluizioni scalari in base dieci.

La procedura è illustrata in figura.

 

 

Il trasferimento da una provetta all’altra avviene tramite pipetta sterile.

N.B. Nel passare da una soluzione più concentrata ad una meno concentrata si è obbligati a cambiare ad ogni passaggio la pipetta per non trascinarsi dietro cellule indesiderate!

Quando invece dobbiamo riversare il contenuto delle provette sulle piastre e cominciamo a farlo dalla più diluita possiamo utilizzare la stessa pipetta.

 

Una volta preparate le provette riversiamo un ml di soluzione da quelle con diluizione 10-4, 10-5,10-6 in piastre di Petri e poi vi riversiamo anche l’agar (che nel frattempo si sarà raffreddato a sufficienza da  poterlo prendere senza guanto).

 

Facciamo miscelare bene la soluzione con l’agar agitando circolarmente la piastra.

Una volta solidificatosi il tutto capovolgo la piastra in modo da evitare la formazione di condensa.

 

Quello che ci aspettiamo è che ogni batterio dia luogo ad una colonia che poi sarà contata per determinare la concentrazione iniziale del campione.

Comunque, bisogna tener presente che se normalmente un batterio forma arrangiamenti di cellule multiple, come le catene, le unità formanti colonie (CFU) possono essere una catena di cellule piuttosto che una singola. È per questo motivo che usualmente si dice che si sta determinando il numero di CFU della soluzione conosciuta.

 

Si scieglie una piastra contenente dalle 30-300 colonie per avere un numero significativo statisticamente. Generalmente, si vuole determinare il numero di CFU per millilitro di campione. Per fare questo il numero di colonie è moltiplicato per il numero di volte che il ml originale di batteri è stato diluito (il fattore di diluizione della piastra contata).

Per esempio, se una piastra contenente una diluizione 1/1,000,000 dilution del ml originale del campione mostra 150 colonie, allora 150 rappresenta 1 milionesimo del numero di CFU presenti nel ml originale. Perciò il numero di CFU per ml nel campione originale si trova moltiplicando  150 x 1,000,000 come mostrato nella formula sotto:

Il numero di CFU per ml di campione =

Numero di colonie (30-300 per piastra) X il fattore di diluizione della piastra contata

Nel caso dell’esempio sopra, 150 x 1,000,000 = 150,000,000 CFU per ml.

N.B. Per avere una conta più accurata è consigliabile inlcudere su piastra ogni diluizione 2 o 3 volte e quindi ricavare una media delle CFU contate.