Autore Bruno Pacifici

La sterilizzazione

La completa eliminazione di tutti i microrganismi presenti in un dato ambiente è chiamata sterilizzazione, e può essere ottenuta utilizzando calore, mezzi fisici (rimozione delle cellule), radiazioni o agenti chimici. Dato che la sterilizzazione prevede la distruzione di tutti i microrganismi presenti, una volta che un prodotto è stato sterilizzato e correttamente sigillato, rimarrà sterile indefinitamente.

* mediante calore

* con mezzi fisici

* con radiazioni

* con agenti chimici

Sterilizzazione mediante calore

  1. L’incenerimento: si bruciano gli organismi distruggendoli fisicamente. Usato per aghi , anse, vetreria, etc. e altri oggetti che non ne risentono nella struttura.
  2. La bollitura: 100°C per 30 minuti. Uccide ogni cosa eccetto alcune endospore (Veramente, se si vuole purificare l’acqua 100°C per cinque minuti è adeguato sebbene ci sono stati casi di cisti di Guardia che sono sopravvissute). Per uccidere le endospore, e perciò sterilizzare la soluzione, viene richiesta una bollitura lunga e intermittente.
  3.  L’autoclave (vapore sotto pressione or pentola a pressione): 121°C per 15 minuti. Buono per sterilizzare quasi ogni cosa, tranne le sostanze termolabili che verranno denaturate o distrutte.
  4. Calore secco (forno d’aria calda): 160°C/2ore or 170°C/1ora. Usata per vetreria, metallo, e oggetti che non fondono.

Il protocollo e le raccomandazioni d’uso del calore per la sterilizzazione sono in questa tabella.

Trattamento

Temperatura

Efficacia

Incenerimento

>500°C

Vaporizes organic material on nonflammable surfaces but may destroy many substances in the process

Bollitura

100°C

30 minutes of boiling kills microbial pathogens and vegetative forms of bacteria but may not kill bacterial endospores

Bollitura intermittente

100°C

Three 30-minute intervals of boiling, followed by periods of cooling kills bacterial endospores

Autoclave e pentola a pressione

121°C/15 minutes

kills all forms of life including bacterial endospores. The substance being sterilized must be maintained at the effective T for the full time

Calore secco

160°C/2 hours

For materials that must remain dry and which are not destroyed at T between 121°C and 170°C Good for glassware, metal, not plastic or rubber items

Calore secco

170°C/1 hour

Same as above. Note increasing T by 10 degrees shortens the sterilizing time by 50 percent

Pastorizzazione (batch method)

63°C/30 minutes

kills most vegetative bacterial cells including pathogens such as streptococci, staphylococci and Mycobacterium tuberculosis

Pastorizzazione (flash method)

72°C/15 seconds

Effect on bacterial cells similar to batch method; for milk, this method is more conducive to industry and has fewer undesirable effects on quality or taste

 

 

Il calore è l'agente sterilizzante più efficace e più utilizzato. Se consideriamo gli effetti della temperatura sulla vitalità cellulare, sappiamo già che, quando la temperatura supera la temperatura massima che consente la crescita iniziano a manifestarsi fenomeni di letalità. Come è illustrato nella Figura, la letalità dovuta all'innalzamento di temperatura è una funzione esponenziale o di primo ordine, cioè il numero di cellule che muoiono aumenta in progressione geometrica in funzione del tempo di esposizione; dalla stessa figura si può, inoltre, osservare che la morte delle cellule è tanto più rapida quanto più aumenta la temperatura. Poiché la cinetica di mortalità illustrata nella Figura è una relazione di primo ordine possiamo dire che, ad una data temperatura, la frazione di cellule che muoiono in ogni intervallo di tempo è proporzionale solo al numero di cellule presenti in quel momento e che, quindi, il tempo necessario per uccidere una determinata frazione di cellule (per esempio, il 90%) è indipendente dal numero iniziale di cellule. Queste considerazioni hanno importanti conseguenze pratiche: infatti, il tempo necessario per una sterilizzazione sarà più lungo se si opera a bassa temperatura piuttosto che a temperatura più alta. E` quindi, necessario determinare il tempo e la temperatura di trattamento per ottenere una sterilizzazione efficace. Anche il vettore usato per la diffusione del calore è importante, il calore umido infatti ha un potere di penetrazione maggiore del calore secco.

 

Il metodo più utile per caratterizzare l'inattivazione dovuta al calore consiste nel determinare il tempo necessario per uccidere una precisa frazione della popolazione. In questo senso il parametro più utilizzato è il tempo di riduzione decimale (D) cioè il tempo necessario per ridurre di dieci volte il numero delle cellule vitali. Nell'intervallo di temperature solitamente utilizzato per la sterilizzazione degli alimenti, la relazione tra D e la temperatura è esponenziale; quindi, ponendo in grafico il logaritmo di D contro la temperatura, la funzione che si ottiene è quella di una retta (Figura).  La pendenza della retta fornisce una indicazione quantitativa della sensibilità al calore dell'organismo in esame nelle condizioni adottate. Grafici di questo tipo vengono utilizzati per calcolare i tempi di sterilizzazione necessari in diversi processi, come ad esempio nella sterilizzazione dei cibi in scatola.

 

Sebbene il metodo descritto sia accurato, la sua attuazione è piuttosto laboriosa, in quanto è necessario allestire un numero molto elevato di conte vitali.

 

Un metodo meno preciso, ma di più facile attuazione, consiste nel determinare il tempo di inattivazione termica, cioè il tempo necessario per uccidere tutte le cellule di una popolazione a una data temperatura. Questo dato viene ottenuto semplicemente scaldando per tempi diversi delle aliquote di una sospensione batterica, ogni aliquota viene poi inoculata in una provetta contenente il terreno colturale e incubata. Il campione che dopo incubazione non presenta traccia di crescita è quello inoculato con quell'aliquota di sospensione che aveva subito un trattamento sufficiente a uccidere tutte le cellule. Naturalmente, il tempo di inattivazione termica dipende dalle dimensioni della popolazione, in quanto sarà necessario un tempo più lungo per uccidere tutte le cellule di una popolazione di grandi dimensioni che non di una popolazione di dimensioni inferiori. Standardizzando il numero di cellule è, comunque, possibile confrontare la sensibilità al calore di organismi diversi semplicemente confrontando i rispettivi tempi di inattivazione termica. Ponendo in grafico il logaritmo del tempo di inattivazione termica contro la temperatura, si ottiene un grafico simile a quello illustrato nella Figura 8.24.

Le spore e la sterilizzazione mediante calore

Le endospore e le cellule vegetative sono molto diverse per quanto riguarda la rispettiva resistenza al calore. In una autoclave, per esempio, si raggiunge normalmente una temperatura di 121ºC in queste condizioni possono essere necessari 4 o 5 minuti per la riduzione decimale delle endospore, mentre per la riduzione decimale delle cellule vegetative sono sufficienti solo 0,l - 0,5 minuti. La pratica della sterilizzazione mediante calore risolve, quindi, il problema della sterilizzazione delle endospore.

 

Anche la natura del materiale che viene sottoposto a sterilizzazione influenza l'efficienza dell'eliminazione di spore e cellule vegetative. La morte batterica infatti è più rapida a pH acidi, ed è per questo motivo che cibi acidi, come i pomodori, la frutta e i sottaceti, sono molto più facili da sterilizzare di quelli a pH neutro, come il mais e i fagioli. Elevate concentrazioni di zuccheri, proteine e grassi si oppongono alla penetrazione del calore e di solito aumentano la resistenza dei microrganismi al calore. mentre elevate concentrazioni di sale possono sia aumentare che diminuire la resistenza al calore, in funzione del microrganismo. Cellule disidratate e spore sono più resistenti al calore delle cellule vegetative; per questo motivo la sterilizzazione mediante calore di materiali privi di acqua richiede sempre temperature più elevate e tempi più lunghi di quelli richiesti da materiali con un certo grado di umidità.

 

Le endospore sono le strutture maggiormente resistenti al calore finora note e sono in grado di sopravvivere a condizioni di riscaldamento che ucciderebbero rapidamente le cellule vegetative della stessa specie. Si ritiene che,uno dei fattori più importanti nel determinare, la resistenza al calore delle endospore sia la quantità e lo stato dell'acqua presente al loro interno, Durante la formazione dell'endospora, il volume del protoplasma viene molto ridotto in seguito all'accumulo di Ca2+ e alla sintesi di acido dipicolinico. che determinano la formazione di una struttura gelatinosa. A questo stadio si forma la spessa corteccia che circonda il protoplasma e la contrazione della corteccia provoca il restringimento del protoplasma e la fuoriuscita di acqua. Il contenuto di acqua del protoplasma determina il grado di resistenza al calore della spora. Se le endospore hanno un contenuto d'acqua relativamente elevato avranno scarsa resistenza al calore, e viceversa modificando il contenuto d'acqua delle spore si altererà la loro resistenza al calore. L`acqua può entrare e uscire liberamente dalle spore, così che non è tanto l'impermeabilità delle tuniche sporali che influenza il contenuto d'acqua quanto piuttosto lo stato fisico del protoplasma, cioè la quantità di dipicolinato di calcio formatasi.

L`autoclave

L`autoclave, uno strumento estremamente importante nella pratica microbiologica, assicura l'uccisione dei microrganismi, incluse le endospore, mediante l'utilizzazione di calore umido.

 

La sterilizzazione mediante calore prevede un trattamento che provoca la completa distruzione di tutti gli organismi e poiché le endospore sono praticamente ubiquitarie, le procedure di sterilizzazione vengono opportunamente programmate per la loro eliminazione. Per ottenere questi risultati è necessario raggiungere temperature superiori al punto di ebollizione dell'acqua, e ciò viene ottenuto immettendo vapore saturo sotto pressione nella camera a chiusura ermetica dell'autoclave (Figura).  Il principio è quello sfruttato dalle normali pentole a pressione, che infatti possono venire utilizzate con risultati soddisfacenti per sterilizzare piccole quantità di materiale. La pressione usualmente utilizzata per la sterilizzazione in autoclave è di l.1 kg/cm2 (corrispondente a 1 atm di sovrapressione), che permette di raggiungere una temperatura di 121ºC; a questa temperatura il tempo di trattamento è generalmente di 10‑15 minuti. Se è necessario sterilizzare oggetti di grandi dimensioni, bisogna tenere presente che la diffusione del calore al loro interno sarà piuttosto lenta, e il tempo di sterilizzazione deve essere. quindi. sufficientemente lungo da consentire, anche alle parti più interne, di rimanere a 121ºC per 10‑15 minuti. Lo stesso vale per grandi volumi di liquidi: anche in questo caso sono necessari, per i motivi appena illustrati, tempi di sterilizzazione più lunghi del normale. E` necessario sottolineare che non è la pressione che si raggiunge all'interno dell'autoclave che provoca la morte dei microrganismi; il fattore letale è, infatti, l'elevata temperatura che si può raggiungere a pressioni superiori a quella atmosferica Il vapore è il vettore del calore.

Pastorizzazione

La pastorizzazione è un processo in cui viene utilizzato un blando riscaldamento per ridurre la carica batterica nel latte e in altri alimenti che non possono essere trattati ad alte temperature. Dal momento che si riduce la carica batterica non è una sterilizzazione. Questo procedimento prende il nome da Louis Pasteur, che per primo utilizzò il calore per limitare il deterioramento del vino. Originariamente, la pastorizzazione veniva utilizzata per eliminare microrganismi patogeni che potevano essere presenti nel latte, specialmente gli agenti patogeni della tubércolosi, della brucellosi, della febbre Q e della febbre tifoide, ma ben presto ci si accorse che questo processo aumentava anche la possibilità di conservazione di questo alimento.

 

Come da tabella iniziale la pastorizzazione del latte viene solitamente attuata facendo fluire il latte in modo continuo attraverso uno scambiatore di calore che permette il rapido innalzamento della temperatura a 71ºC, questa temperatura viene mantenuta per 15 secondi e, quindi, il latte viene raffreddato rapidamente; l'intero processo viene chiamato pastorizzazione istantanea (flash). In alcuni casi la pastorizzazione viene effettuata scaldando l'intera massa di latte a 63‑66ºC per 30 minuti e, quindi, raffreddandolo velocemente (batch method). Il primo sistema è però preferibile, perché è più efficiente nell'eliminazione dei microrganismi resistenti al calore, altera di meno le caratteristiche organolettiche e inoltre può essere attuato in sistemi a flusso continuo, il che lo rende particolarmente adatto alle operazioni lattiero‑casearie su larga scala. Di fatto, le moderne industrie lattiero‑casearie adottano sempre il primo metodo di pastorizzazione e, al giorno d'oggi stanno diventano sempre più comuni i procedimenti che prevedono l'esposizione a temperature anche maggiori per tempi più brevi.

Sterilizzazione con mezzi fisici:

la filtrazione

Il calore, pur essendo il mezzo più comune e più efficiente per sterilizzare i liquidi, non può però essere utilizzato per sterilizzare soluzioni contenenti sostanze termolabili. Una tecnica molto valida per sterilizzare materiale di questo tipo è la filtrazione. Un filtro è costituito da materiale poroso attraverso il quale viene fatta passare la soluzione da sterilizzare; il diametro dei pori deve essere tale da permettere il passaggio del liquido, ma impedire il passaggio dei microrganismi. Le dimensioni delle particelle che devono essere eliminate nella sterilizzazione per filtrazione sono molto variabili: le cellule batteriche più grandi possono avere diametro superiore al 10 mm mentre le dimensioni di alcuni batteri possono essere inferiori a 0,3 mm I filtri sono usati frequentemente anche in virologia, il cui oggetto di studio, i virus. sono di dimensioni ancora più piccole, circa 10 nm.

Esistono tre principali tipi di filtri, illustrati nella Figura.

 

FIGURA Confronto tra la struttura di (a) un filtro a spessore, (b) una membrana filtrante convenzionale, e (c) un fibra tipo Nuclepore.

 

I filtri di tipo più vecchio, detti anche filtri a spessori, sono costituiti da strati fibrosi di carta, amianto (filtri Seitz) o lana di vetro, in cui le fibre sono disposte in modo casuale. In questi filtri, le particelle rimangono intrappolate nel pori tortuosi che si creano nello spessore del filtro stesso. Anche se con questi materiali è possibile costruire filtri utilizzabili per rimuovere particelle delle dimensioni delle cellule batteriche o dei virus, le limitazioni da essi presentate sono tali da rendere sconsigliabile il loro uso. Di fatto, al giorno d'oggi questi filtri vengono utilizzati solo per le operazioni di prefiltrazione, cioè per rimuovere da una soluzione le particelle di maggiori dimensioni che potrebbero intasare i filtri utilizzati nel processo di sterilizzazione vera e propria. L'impiego più comune di questi filtri è la sterilizzazione per filtrazione dell'aria in processi industriali.

 

In microbiologia, i filtri più comuni usati per la sterilizzazione sono le membrane filtranti. Le membrane filtranti sono costituite da dischetti molto resistenti di acetato di cellulosa o nitrato di cellulosa e sono costruiti in modo tale da creare nello spessore del filtro molti pori di piccolissime dimensioni. Le membrane filtranti differiscono dai filtri descritti in precedenza in quanto il loro funzionamento è abbastanza simile a quello di un setaccio, che blocca la maggior parte delle particelle alla superficie. Le membrane filtranti sono strutture aperte. in cui l'80‑85% del volume del filtro è occupato dall'aria. Questa struttura consente una velocità di flusso dei fluidi piuttosto elevata. Nelle membrane filtranti convenzionali, comunque, molte particelle penetrano nella matrice del filtro dove rimangono intrappolate.

 

Il terzo tipo di filtri più comunemente utilizzati sono i filtri tipo Nuclepore, che vengono prodotti trattando un sottile strato di policarbonato (spessore 10 um) prima con radiazioni nucleari e poi con un composto chimico corrosivo. Le radiazioni causano dei danni localizzati nello strato di policarbonato, mentre il trattamento chimico corrode i punti danneggiati causando la formazione di pori. Il diametro dei pori può essere controllato in modo preciso dosando attentamente il composto chimico utilizzato e il tempo di trattamento. Filtri di questo tipo hanno solitamente pori di diametro uniforme disposti verticalmente nello spessore del filtro. Questi filtri funzionano esattamente come dei setacci, trattenendo tutte le particelle il cui diametro sia maggiore di quello dei pori. Comunque. data la scarsa porosità, la velocità di flusso di un fluido attraverso questi filtri è decisamente inferiore a quella delle membrane filtranti ed inoltre si intasano più rapidamente. I filtri di questo tipo sono largamente utilizzati nella microscopia elettronica a scansione, n quanto permettono di rimuovere facilmente le cellule dalla fase liquida; Inoltre, tutte le particelle filtrate rimangono disposte su un piano uniforme alla superficie del filtro, rendendo semplice e veloce l'allestimento del preparato.

 

L'utilizzazione di una membrana filtrante per la sterilizzazione di un liquido è illustrata nella Figura sotto. Di solito, l'apparato per la filtrazione viene sterilizzato separatamente dal filtro. che viene poi montato asetticamente al momento dell`uso.  L`apparecchio illustrato nella Figura è adatto per filtrare piccoli volumi di liquido, mentre per grandi volumi il materiale che costituisce la membrana filtrante viene inserito in una cartuccia chiusa in un contenitore metallico. La filtrazione di grandi volumi di liquidi contenenti sostanze termolabili è pratica comune nell`Industria farmaceutica.

 

 

 

La maggior parte delle membrane filtranti può essere sterilizzata in autoclave e, quindi, maneggiata asetticamente nel momento in cui è necessario montare l'apparato di filtrazione . Il liquido attraverso il filtro e raccogliendolo in un recipiente sterile.

 

 

 

Radiazioni

Solitamente distruggono o alterano gli acidi nucleici. Vengono comunemente usati i raggi UV (comunemente usati per sterilizzare le superfici degli oggetti), sebbene vengano usati anche i raggi X e le microonde. Molti organismi vengono facilmente uccisi dalle radiazioni. In alcune parti d’Europa, frutti e vegetali vengono irradiati per incrementare la loro durata sugli scaffali fino al 500%.

Questa pratica non viene accettata negli U.S. sebbene l’ FDA abbia approvato il suo uso per gli alimenti.

Con agenti chimici e gas

Formaldeide, glutaraldeide, ossido di etilene uccidono ogni forma di vita in una specializzata camera a gas.

Approfondisci in “Uso di agenti chimici nel controllo della crescita microbica”