Ricerca applicata : per ottenere microrganismi in grado di produrre composti utili come l’insulina umana, l’ormone della crescita umano, l’interferone, i vaccini ed enzimi di interesse industriale. Quando è applicata per scopi industriali è detta biotecnologia e sembra avere potenzialità illimitate.

I principi basilari dell’ingegneria genetica

Le conoscenze essenziali per lo sviluppo dell'ingegneria genetica sono schematizzate nella Figura

l. Chimica del DNA: sviluppo di procedure per l'isolamento, il sequenziamento e la sintesi del DNA.

2. Enzimologia del DNA: isolamento di endonucleasi di restrizione, DNA ligasi e DNA polimerasi.

3. Replicazione del DNA: comprensione del meccanismo di replicazione del DNA e dell'importanza dei vettori in grado di replicarsi autonomamente.

4. Plasmidi: isolamento di plasmidi e determinazione del loro meccanismo di replicazione.

5. Batteriofagi temperati: comprensione del meccanismo di controllo della replicazione e/o integrazione da parte del DNA di batteriofagi temperati.

6. Trasformazione: individuazione di metodi per l'introduzione di DNA libero nelle cellule.

7. Chimica ed enzimologia dell'RNA: identificazione delle metodologie per l'estrazione e lo studio dell'mRNA, comprensione del meccanismo di formazione dell'RNA e dell'importanza del suo processamento nella formazione di un mRNA maturo eucariotico. Sviluppo di metodi per la sintesi di RNA.

8. Retrotrascrizione: identificazione dell'enzima virale trascrittasi inversa e suo sviluppo come mezzo per retrotrascrivere l'informazione genetica da mRNA al DNA.

9. Regolazione: comprensione dei fattori coinvolti nella regolazione della trascrizione, inclusa l'identificazione dei promotori e del controllo degli operoni.

10. Traduzione: comprensione delle tappe coinvolte nella traduzione, dell'importanza del sito di legame al ribosoma sull'mRNA, del ruolo del codone di inizio e dell'importanza di una corretta fase di lettura.

11. Chimica delle proteine: sviluppo di metodi per l'isolamento, la purificazione, la valutazione e il sequenziamento delle proteine.

12. Secrezione e modificazione post‑traduzionale delle proteine: comprensione del meccanismo di sintesi delle proteine prodotte con sequenze segnale, rimosse durante o dopo la secrezione. Identificazione di altri tipi di modificazioni post‑traduzionali delle proteine, come la rimozione di peptidi localizzati all'estremità aminoterminale.

13. Codice genetico: Individuazione del codice genetico e determinazione della sua universalità in quasi tutti gli organismi. Comprensione dell'importanza di una corretta fase di lettura e della presenza di alcuni codoni usati meno frequentemente in alcuni organismi rispetto ad altri.

Il clonaggio

Lo scopo del clonaggio è quello di isolare grandi quantità di geni specifici in forma pura. La strategia alla base consiste nel trasferimento del gene desiderato da un genoma grande e complesso ad uno piccolo e semplice. Fortunatamente, le nostre conoscenze di chimica e di enzimologia degli acidi nucleici ci permettono di tagliare e riunire molecole di DNA in vitro. Questo processo è noto come ricombinazione in vitro.

Il clonaggio genico può essere suddiviso in 5 passaggi:

1. Isolamento e frammentazione del DNA.

Ligazione del frammento di DNA con un vettore di clonaggio [B.P.1] mediante la DNA ligasi.

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I vettori di clonaggio sono generalmente costruiti per permettere l'introduzione di DNA esogeno a livello di un sito di restrizione che taglia il vettore in modo tale che non sia compromessa la sua replicazione. Se il vettore e il DNA che deve essere inserito sono tagliati con lo stesso enzima di restrizione, la successiva unione di queste due molecole può essere favorita dall'appaiamento di regioni a singolo filamento denominate "estremità coesive". E` possibile unire estremità piatte generate da enzimi di restrizione diversi; inoltre estremità coesive diverse o estremità piatte possono essere congiunte mediante l'uso di adattatori e di "linkers" (giunzioni) costituiti da DNA sintetico.

3. Introduzione nell'ospite con la trasformazione o mediante l’infezione con particelle fagiche costruite mediante impacchettamento in vitro. L`incorporazione del DNA nell'ospite generalmente genera una miscela di cloni (genoteca).

4. Isolamento e purificazione del clone desiderato.

5. Produzione di un elevato numero di cellule o batteriofagi contenenti il clone desiderato per l'isolamento e lo studio del DNA clonato.

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plasmidi come vettori di clonaggio

Abbiamo già discusso alcuni dettagli relativi ai plasmidi. Essi hanno proprietà molto utili per il clonaggio. Queste proprietà includono:

(1) dimensioni ridotte che facilitano l'isolamento e la manipolazione del DNA;

(2) forma circolare che rende il DNA più stabile durante l'isolamento;

(3) origine di replicazione indipendente, in modo tale che la replicazione del plasmide nella cellula proceda indipendentemente dal controllo diretto del cromosoma;

(4) elevato numero di copie nella cellula che rende possibile l'amplificazione del DNA;

(5) presenza di marcatori selezionabili, quali la resistenza ad antibiotici, che semplificano l'identificazione e l'isolamento dei cloni contenenti plasmidi.

Sebbene in condizioni naturali i plasmidi coniugativi siano generalmente trasferiti attraverso il contatto tra le cellule, i vettori di clonaggio vengono spesso modificati, per ragioni di sicurezza, per prevenire il loro trasferimento mediante coniugazione. Infatti, in laboratorio, l'introduzione di un vettore in un ospite può essere effettuato mediante trasformazione. A seconda del sistema ospite‑plasmide, la replicazione del plasmide può avvenire sotto stretto controllo cellulare, nel qual caso le copie prodotte sono poche, oppure con un controllo cellulare più blando e la produzione di un numero elevato di copie. Spesso in un clonaggio genico è importante avere un alto numero di copie; attraverso un`appropriata scelta del sistema ospite‑plasmide e l'alterazione della sintesi delle macromolecole cellulari è possibile ottenere diverse migliaia di plasmidi per cellula.

Il plasmide pBR322 è un esempio di un vettore di clonaggio molto usato, in grado di replicarsi In Escherichia coli. Il plasmide pBR322 ha diverse caratteristiche che lo rendono utile come vettore di clonaggio:

I. E` relativamente piccolo, solo 4361 paia di basi.

2. Si mantiene stabilmente nel suo ospite (Escherichia coli) ad un numero relativamente alto di copie per cellula (20‑30).

3. Può essere amplificato fino ad un numero elevato (1000‑3000 copie per cellula, circa il 40% del genoma!) mediante l'aggiunta di cloramfenicolo, che inibisce la sintesi proteica.

4. E` facile da isolare in forma superavvolta mediante diverse tecniche semplici .

5. E` possibile l'inserimento di una discreta quantità di DNA, nonostante che inserti superiori alle 10 chilobasi portino alla instabilità plasmidica.

6. Essendo nota l'intera sequenza delle basi di questo plasmide, è possibile localizzare i siti riconosciuti da enzimi di restrizione.

7. Sono presenti siti unici per diversi enzimi di restrizione come PstI, SalI, EcoRI, HindIII, BamHI e molti altri. Il sito EcoRI è localizzato tra i geni che codificano per la resistenza agli antibiotici presenti sul plasmide. È importante la presenza di un sito unico per almeno un enzima di restrizione, in modo tale che il trattamento con quell'enzima linearizzi il plasmide, senza frammentarlo.

8. Sono presenti due marcatori di resistenza agli antibiotici, ampicillina e tetraciclina che permettono una facile selezione delle cellule ospiti contenenti il plasmide.

9. Può essere facilmente introdotto nelle cellule mediante la trasformazione. Come abbiamo visto, il sito BamHI è all'interno del gene per la resistenza alla tetraciclina e il sito PstI in quello per la resistenza all'ampicillina. Se un frammento di DNA esogeno viene inserito in uno di questi siti, la resistenza all'antibiotico conferita dal gene localizzato in quel punto viene persa con un fenomeno detto inattivazione inserzionale. Questa inattivazione è utilizzata per identificare la presenza di DNA esogeno nel plasmide. Quindi, se pBR322 viene digerito con BamHI, legato al DNA da inserire e successivamente vengono isolati i cloni batterici trasformati, i cloni selezionati che risultano resistenti sia all'ampicillina che alla tetraciclina sono quelli che non hanno inserito il DNA esogeno (il plasmide incorporato nella cellula è il vettore che si è richiuso senza introduzione di DNA esogeno). Al contrario, quelle cellule che sono ancora resistenti all'ampicillina, ma sensibili alla tetraciclina, contengono il plasmide nel quale si è inserito DNA esogeno. Poiché la resistenza a questi due antibiotici può essere valutata su piastre di terreno agarizzato, è possibile individuare facilmente i batteri contenenti il clone desiderato ed eliminare le cellule che non contengono il plasmide.

I primi vettori di clonaggio utilizzati sono stati i plasmidi presenti in natura. Il plasmide pBR322 rappresenta una generazione più recente di vettori di clonaggio, costruiti in vitro. Il gene per la resistenza alla tetraciclina in pBR322 deriva da un plasmide, l'origine di replicazione da un altro e il gene per la resistenza all'ampicillina dal trasposone Tn3. Sono ora disponibili nuove generazioni di vettori plasmidici costruiti con caratteristiche utili e di facile impiego. Queste nuove caratteristiche includono quasi sempre un "polylinker" (o sito di clonaggio multiplo), un breve segmento di DNA con molti siti di restrizione unici. Questo "polylinker" è generalmente contenuto nella regione codificante di un gene la cui inattivazione inserzionale può essere facilmente identificata. Queste caratteristiche si ritrovano anche nei vettori fagici.

Il clonaggio in un plasmide come pBR322 è una procedura versatile e abbastanza generale, di uso diffuso in ingegneria genetica, in particolare quando il frammento che deve essere clonato è abbastanza piccolo. I plasmidi sono i vettori migliori quando si desidera l'espressione del gene che si è clonato.

batteriofagi come vettori di clonaggio

Abbiamo discusso il batteriofago lambda e il fatto che possa essere utilizzato come fago trasducente specializzato. Durante la trasduzione specializzata, lambda si comporta come un vettore, anche se la ricombinazione non avviene in provetta ma nella cellula. Lambda può anche essere utilizzato come vettore di clonaggio per la ricombinazione in vitro. E` un vettore particolarmente utile poiché è ben conosciuto da un punto di vista molecolare, può contenere quantità di DNA più elevate della maggior parte dei plasmidi e il DNA può essere efficientemente impacchettato nelle particelle fagiche in vitro. Inoltre, può essere utilizzato per infettare opportune cellule ospiti (trasfezione), processo molto più efficiente della trasformazione. Il fago lambda ha una mappa genetica complessa ed un elevato numero di geni. Tuttavia, la regione centrale del genoma di lambda, compresa tra i geni J ed N, non è essenziale e può essere sostituita con DNA esogeno.

Vettori derivati dal fago lambda

Il fago lambda "wild‑type" non è un vettore di clonaggio adeguato poiché possiede molti siti per enzimi di restrizione. Per superare questo inconveniente sono stati costruiti fagi lambda modificati utilizzabili per il clonaggio. In un gruppo di fagi lambda modificati, chiamati fagi "Charon' (Caronte), i siti di restrizione indesiderati sono stati rimossi attraverso mutazioni puntiformi, delezioni o sostituzioni. In questi derivati in cui è presente un solo sito di restrizione, il pezzo di DNA esogeno viene inserito, mentre nei derivati con due siti il DNA esogeno può sostituire parte del DNA del fago. Questo secondo tipo di vettore, denominato vettore di sostituzione, è particolarmente utile quando deve essere clonato un frammento di DNA di grosse dimensioni. Entrambi i vettori presentano mutazioni per sostituzione. Uno dei geni inseriti per sostituzione è quello della b‑galattosidasi. Quando il vettore si replica in un ceppo di Escherichia coli incapace di utilizzare il lattosio (Lac‑), la b‑galattosidasi viene sintetizzata dal gene portato dal fago e la presenza di placche Lac+ (lattosio positive) può essere evidenziata in piastra mediante l'impiego di un indicatore che cambia colore in funzione dell'espressione o meno della b‑galattosidasi. Se un gene esogeno viene inserito nel gene per la b‑galattosidasi, il carattere Lac+ viene perso [B.P.2] . In queste condizioni le placche Lac‑ possono essere facilmente identificate come placche bianche in mezzo ad una miriade di placche colorate.

Clonaggio con lambda

Il clonaggio con i vettori derivati da lambda prevede i seguenti passaggi:

1. Isolamento del vettore da particelle fagiche e sua digestione con l`enzima di restrizione appropriato.

2. Unione dei due frammenti di lambda con il frammento di DNA esogeno mediante DNA ligasi. Le condizioni scelte permettono la formazione di molecole di DNA di lunghezza tale da poter essere inserito nella particella fagica mediante impacchettamento.

3. Impacchettamento del DNA mediante aggiunta di estratti cellulari contenenti le proteine della testa e della coda che permettono la formazione di particelle fagiche vitali.

4. Infezione di E. coli e isolamento dei cloni fagici mediante replica delle placche in un ceppo ospite.

5. Controllo della presenza del frammento di DNA desiderato nei fagi ricombinanti, mediante tecniche di ibridazione o osservazione delle caratteristiche genetiche.

La selezione dei ricombinanti è più semplice con i vettori derivati da lambda (es. "Charon" 4A) rispetto ai plasmidi, poiché (1) l'efficienza di trasferimento nella cellula del DNA ricombinante mediata da lambda è molto alta, (2) I frammenti di lambda che non hanno ricevuto DNA esogeno sono troppo piccoli per essere incorporati nelle particelle fagiche. Sebbene lambda sia un utile vettore di clonaggio ci sono dei limiti nella quantità di DNA che può essere inserita. La vitalità delle particelle fagiche è bassa se il DNA è più lungo del 105 percento del genoma normale di lambda ed inoltre alcuni geni non possono essere eliminati senza che il vettore perda la sua capacità di replicarsi. Quindi frammenti di DNA di grosse dimensioni (più di 20 chilobasi) non possono essere efficientemente clonati.

Cosmidi

Un cosmide è un vettore che utilizza specifici geni di lambda. I cosmidi sono vettori plasmidici in cui sono stati inseriti i siti cos (estremità coesive) del genoma di lambda. Questi siti sono richiesti per impacchettare il DNA nel virione di lambda. I plasmidi modificati possono essere impacchettati in vitro nel virione lambda, come descritto sopra, e le particelle fagiche utilizzate per trasdurre Escherichia coli. Quindi, utilizzando i cosmidi, non è richiesta la trasformazione di E. coli, processo poco efficiente.

Uno dei maggiori vantaggi forniti dai cosmidi è dato dalla possibilità di clonare grossi frammenti di DNA.

In queste condizioni sono sufficienti pochi cloni perché l'intero elemento genetico possa essere rappresentato. Questo è utile soprattutto per il clonaggio di geni cromosomali di eucarioti dove sono presenti grandi quantità di DNA. Un altro vantaggio dei cosmidi è dato dal fatto che il DNA può essere immagazzinato in una particella fagica invece che in un plasmide. Le particelle fagiche sono molto più stabili di un plasmide e il DNA ricombinante può essere mantenuto per lunghi periodi di tempo (genoteca).

Altri tipi di vettori

Sono stati sviluppati diversi vettori utilizzabili per scopi differenti nella tecnologia del DNA ricombinante. In questo paragrafo discuteremo altri tipi di vettori e alcune loro modificazioni utili.

Cromosomi artificiali di lievito o YAC (yeast artificial chromosomes) e progetto genoma umano

Come abbiamo già ricordato, i vettori plasmidici generalmente possono contenere una quantità di DNA inferiore ai vettori lambda che a loro volta ne contengono meno rispetto ai cosmidi. Quando si deve costruire una genoteca di batteri o eucarioti semplici è possibile usare vettori lambda o cosmidi; in questi casi l'intera genoteca conterrà al massimo poche migliaia di cloni diversi. Le dimensioni di una genoteca (cioè il numero di cloni) richieste perché possa essere contenuto il genoma completo di un organismo dipendono sia dalle dimensioni del genoma, sia dalla lunghezza dei frammenti inseriti nel vettore. Se la dimensione media dell'inserto è 20 chilobasi, saranno necessari molti più cloni per costruire una genoteca di un genoma di mammifero (3 x 10⁹ paia di basi) rispetto a quelli richiesti per un genoma batterico (4 x 10⁶ paia di basi). Attualmente gli sforzi della comunità scientifica Internazionale sono rivolti alla mappatura, clonaggio e sequenziamento dell'intero genoma umano aploide (Progetto genoma umano). Si tratta chiaramente di un`impresa molto più impegnativa del sequenziamento del cromosoma di Escherichia coli. Per un progetto del genere è necessario disporre di un vettore di clonaggio che possa contenere grossi segmenti di DNA per limitare le dimensioni della genoteca. Sono stati costruiti vettori di questo genere denominati cromosomi artificiali di lievito o YAC (yeast artificial chromosomes).

I vettori YAC sono in grado di replicarsi in lievito come normali cromosomi, ma contengono siti dove può essere inserito DNA. Per poter funzionare come normali cromosomi eucariotici, i vettori YAC devono avere:

1. un origine di replicazione,

2. telomeri all'estremità del cromosoma

3. un centromero (la porzione del cromosoma richiesta per la segregazione durante la mitosi).

4. Inoltre devono contenere un sito di clonaggio e un gene che possa essere utilizzato per la selezione dell'ospite dopo trasformazione.

Le dimensioni di un vettore YAC sono solo circa 10 chilobasi, ma possono contenere da 200 a 800 chilobasi di DNA clonato. Dopo l'identificazione di un gene particolare o di una regione del DNA clonato nel vettore YAC, è possibile subclonarlo in un plasmide o in un batteriofago per un'analisi genetica più dettagliata.

Vettori per il sequenziamento del DNA: il batteriofago M13

Questo fago filamentoso contiene DNA a singolo filamento e si replica senza uccidere il suo ospite. Le particelle mature di M13 vengono rilasciate dalla cellula ospite attraverso un processo di gemmazione, ed è possibile ottenere colture cronicamente infettate che possono fornire DNA fagico. Un`importante caratteristica del fago M13 è quella di contenere DNA a singolo filamento. Per sequenziare il DNA utilizzando la metodica di Sanger, è necessario disporre di DNA a singolo filamento e il DNA clonato nel fago M13 fornisce una fonte di DNA di questo tipo. Inoltre, il DNA a singolo filamento è molto utile come sonda per individuare altre sequenze di DNA, come in esperimenti di ibridazione dopo trasferimento tipo Southern, e M13 permette di produrre facilmente sonde a singolo filamento.

Per poter essere utilizzato per il clonaggio, il fago M13 deve essere disponibile anche in forma a doppia elica, poiché gli enzimi di restrizione tagliano solo il DNA a doppio filamento. È possibile ottenere DNA di M13 a doppia elica dalle cellule infettate, in quanto M13 si replica nell'ospite attraverso una forma replicativa a doppia elica.

La maggior parte del genoma del fago M13 "wíldtype" contiene l'informazione genetica essenziale per la replicazione virale. Esiste tuttavia una piccola regione, denominata sequenza intergenica, che può essere utilizzata come sito di clonaggio. Senza compromettere la vitalità del fago è possibile clonare molecole di DNA di lunghezza variabile, fino a 5 kb, in quanto le dimensione del virione si adattano a quelle del suo genoma. Il fago M13mp18 è un derivato di M13 nel quale la regione intergenica è stata modificata per facilitare il clonaggio.

Una modificazione consiste nell'introduzione del gene lacZ, che in E. coli codifica l'enzima b‑galattosidasi. Quindi, le cellule infettate con M 13mp18 possono essere facilmente identificate grazie al colore che assumono in piastre con un indicatore. Nel gene lacZ è stato inserito un polylinker di 54 paia di basi. Questo frammento contiene diversi siti di restrizione unici nel fago M13 e può quindi essere utilizzato per il clonaggio. Il polylinker è inserito all'inizio della regione codificante il gene lacZ. Questa piccola regione è in fase e i 18 aminoacidi aggiunti non alterano l'attività dell'enzima codificato dal gene. Tuttavia, l'inserimento di DNA nel polylinker durante il clonaggio inattiva il gene. I fagi che contengono DNA esogeno formano placche non colorate e quindi risulta molto semplice identificare i cloni. Viene utilizzata una strategia simile anche nei vettori di clonaggio di lambda per permettere l'identificazione di cellule contenenti il DNA clonato.

Come sono utilizzati i vettori M13 per il clonaggio? La forma replicativa a doppia elica di DNA viene isolata dalla cellula infettata e trattata con un enzima di restrizione. Il DNA da clonare, a doppia elica, viene trattato con lo stesso enzima di restrizione. Dopo la ligazione si ottengono molecole di M13 a doppia elica contenenti il DNA esogeno. Quando, mediante trasformazione, queste molecole vengono introdotte nella cellula, si replicano e danno origine a particelle fagiche mature contenenti molecole di DNA a singolo filamento. Solo un filamento di DNA viene impacchettato nel fago maturo. Quale delle due eliche di DNA esogeno è contenuta nel fago maturo, dipende dall'orientamento con il quale è avvenuto l'inserimento del filamento. E possibile il clonaggio di entrambi i filamenti di DNA poiché le molecole di DNA esogeno possono inserirsi (in fagi diversi) in entrambi gli orientamenti. Il DNA di M13 a singolo filamento contenente il DNA clonato può essere utilizzato per il sequenziamento. Poiché è nota la sequenza delle basi in cui si è inserito il DNA esogeno (essendo nota la specificità dell'enzima di restrizione usato), è possibile sfruttare come innesco un olìgonucleotide sintetico complementare a questa regione e determinare la sequenza dell`intero frammento di DNA a partire da questo punto. Quindi, i fagi derivati da M13 si rivelano estremamente utili per il sequenziamento di molecole, anche piuttosto lunghe, di DNA esogeno. (In questo modo è stata determinata la sequenza del DNA del batteriofago lambda di 48.514 basi).

NOTA:.E` stato costruito un sistema modificato per la produzione di molecole di DNA a singolo filamento inserendo l'origine di replicazione del fago M13 in un vettore plasmidico. Questi plasmidi possono essere usati sia per la manipolazione genetica convenzionale sia per produrre molecole di DNA a singolo filamento infettando cellule contenenti questo plasmide, in presenza di un fago M 13 "helper".

Sono stati costruiti anche vettori ibridi, denominati fasmidi, derivati da un fago filamentoso come M13 e un plasmide. Questi vettori contengono sia l'origine di replicazione del fago sia quella del plasmide. Normalmente la replicazione inizia dal sito di origine del plasmide ma, quando una cellula contenente un fasmide è infettata con un fago "wild‑type", l'origine del fago nel vettore viene utilizzata per sintetizzare DNA a singolo filamento (e qualunque gene clonato). Questo DNA a singolo filamento è impacchettato nel virione e, può essere facilmente isolato ed utilizzato per il sequenziamento. Generalmente, i fasmidi possono portare stabilmente frammenti di DNA clonato più grandi di quelli normalmente contenuti in un vettore derivato dal fago M13.

Altri vettori specializzati

Un'importante classe di vettori, denominati vettori di espressione, vengono utilizzati quando si desidera ottenere la sintesi della proteina codificata dal gene esogeno clonato nel vettore. I vettori di secrezione sono particolari vettori di espressione in cui la proteina non solo è espressa, ma anche secreta (escreta) dalla cellula.

Per diverse ragioni può essere utile trasferire frammenti di DNA tra organismi anche non correlati, ad esempio quando un gene di interesse non è presente in un ceppo "wild‑type" di E. coli, ma in un`aItra specie batterica. In questi casi, per trasferire il frammento di DNA, si utilizza un vettore navetta (shuttle), un vettore in grado di replicarsi in due organismi diversi. Come molti altri vettori specializzati, anche i vettori navetta possono essere costruiti mediante le tecniche del DNA ricombinante. Sono noti vettori navetta in grado di replicarsi in E. coli e in Bacillus subtilis, in E. coli e in lievito, In E. coli e in cellule di mammifero e in molte altre coppie di organismi.

ospiti per i vettori di clonaggio

Le caratteristiche ideali di un ospite per il clonaggio dei geni sono:

crescita rapida,
capacità di crescere in terreni di coltura poco costosi,
non patogenicità,
capacità di essere trasformato con DNA
stabilità in coltura.

Gli ospiti più utili per il clonaggio sono microrganismi, come E. coli. Bacillus subtilis e Saccaromyces cerevisiae, che crescono facilmente e sono noti da un punto di vista genetico.

Ospiti procarioti

Sebbene E. coli sia stato molto sfruttato per il clonaggio non sempre il suo utilizzo è vantaggioso. E. coli è un batterio che vive nell'intestino ed essendo potenzialmente patogeno, risulta poco adatto per la produzione su larga scala di composti derivati da DNA clonato. Inoltre, persino ceppi non patogeni possono produrre endotossine che potrebbero contaminare il prodotto, situazione particolarmente pericolosa per i prodotti farmaceutici iniettabili. Infine, E. coli trattiene le proteine prodotte nello spazio periplasmico rendendo difficile la loro estrazione e purificazione. Tuttavia sono stati selezionati ceppi di E. coli modificati che hanno permesso di superare molti di questi problemi. Grazie infatti alla disponibilità di molte informazioni, sia genetiche sia biochimiche, E. coli rimane l'ospite più adatto per il clonaggio nella ricerca di base.

Anche il batterio Gram‑positivo Bacillus subtilis può essere sfruttato come ospite per il clonaggio. B. subtilis non è potenzialmente patogeno, non produce endotossine e secerne le proteine prodotte nel terreno di coltura. Sebbene le tecnologie per il clonaggio in Bacillus subtilis non siano così sviluppate come quelle in E. coli, sono comunque disponibili plasmidi e fagi adatti e sono state messe a punto procedure di trasformazione adeguate. Esistono comunque alcuni svantaggi nell'utilizzazione di B. subtilis come ospite per il clonaggio. Uno dei problemi è legato all'instabilità plasmidica; è difficile mantenere la replicazione del plasmide dopo molti passaggi in coltura. Inoltre, il DNA esogeno non si mantiene facilmente in B. subtilis e viene spesso perso improvvisamente.

L`adattamento di un batterio da utilizzare come ospite di clonaggio non è sempre semplice.

Ospiti eucarioti

Il clonaggio nei microrganismi eucariotici ha alcuni vantaggi importanti legati soprattutto alla comprensione della regolazione genica in sistemi eucariotici. Il lievito Saccaromyces cerevisiae è il microrganismo eucariotico più conosciuto dal punto di vista genetico e più studiato come ospite per il clonaggio. Per il clonaggio in lievito, sono stati sviluppati vettori come i plasmidi YAC che permettono la trasformazione con DNA geneticamente manipolato. La capacità di clonare in lievito materiale genetico opportuno permetterà di approfondire le nostre conoscenze sui complessi sistemi di trascrizione e traduzione degli eucarioti e fornirà ulteriori informazioni per la ricerca di base.

Spesso, per diverse ragioni è preferibile procedere al clonaggio in cellule di mammifero. Le colture di cellule di mammifero, come quelle batteriche, possono essere manipolate in diversi modi e trovano largo impiego nelle ricerche di genetica umana, biologia dei tumori, malattie infettive e fisiologia. Il DNA può essere introdotto nelle cellule dì mammifero attraverso la trasfezione o l'elettroporazione. Il virus a DNA SV40, un virus che causa tumori nei primati, viene utilizzato come vettore per il clonaggio in colture di linee cellulari di tessuti umani. SV40 è un virus il cui genoma, costituito da una molecola di DNA circolare a doppia elica, è stato interamente sequenziato. Per il clonaggio e l'espressione di geni di mammifero sono stati costruiti derivati del fago SV40 incapaci di indurre il cancro. SV40 e vettori di clonaggio simili dovrebbero rivelarsi estremamente utili per comprendere i meccanismi coinvolti nell'espressione genica degli organismi più complessi.

Anche i retrovirus possono essere utilizzati per introdurre geni in cellule di mammifero, in quanto si replicano attraverso un intermedio a DNA che si integra nel genoma dell'ospite. Anche il virus del vaiolo bovino, un grosso virus il cui genoma è costituito da una molecola di DNA a doppia elica, è stato utilizzato per clonare diversi geni virali, utilizzabili per la preparazione di vaccini.

Un importante vantaggio nell'uso delle cellule eucariotiche come ospiti di vettori di clonaggio, è legato al fatto che esse posseggono già i complessi sistemi di modificazione dell`RNA e di processamento post‑traduzionale coinvolti, negli organismi superiori, nella sintesi di un prodotto genico. Questi sistemi non devono, quindi, essere introdotti nel vettore come avviene quando la produzione della molecola desiderata viene effettuata in un procariote (in particolare i processi post‑traduzionali possono creare alcuni problemi nel clonaggio).

Uno svantaggio nell'utilizzazione di cellule di mammifero come ospiti per il clonaggio è dato dal fatto che, oltre ad essere costose e difficili da produrre su larga scala, presentano spesso livelli di espressione dei geni clonati piuttosto bassi. Poiché linee cellulari di insetto sono più semplici da crescere, sono stati sviluppati vettori di clonaggio basati su un virus a DNA, il baculovirus, in grado di infettare gli insetti. Usando il baculovirus come vettore, si possono ottenere livelli di espressione molto alti.

identificazione del clone corretto

Un punto cruciale nella tecnologia del DNA ricombinante, è l'identificazione del clone corretto nella miscela di cloni che si è formata. Il DNA utilizzato per il clonaggio contiene in genere molti geni, dei quali solo uno o pochi possono essere i geni di interesse. Abbiamo visto come sia possibile selezionare l'ospite contenente il vettore basandoci sulla presenza di un marcatore, come la resistenza ad un antibiotico, portato dal plasmide, in modo che solo queste cellule formeranno colonie. Nel caso di cellule contenenti un vettore virale è possibile osservare semplicemente la formazione di placche. Abbiamo anche visto come le colonie o le placche possano essere analizzate per isolare quelle che presentano all'interno del plasmide un inserto di DNA esogeno, osservando l'inattivazione di un gene del vettore, quale la resistenza ad un antibiotico, nel caso di un plasmide o della b‑galattosidasi, nel caso di un virus. Tuttavia, diventa poi necessario selezionare il clone che contiene il gene di interesse. Sono disponibili diverse procedure per esaminare colonie batteriche o placche di cellule infettate in grado di crescere su una piastra di terreno agarizzato e isolare quelle poche che contengono piccole quantità della proteina o del gene che interessa. Lo scopo di questo paragrafo è quello di discutere i possibili approcci per l'isolamento del clone corretto. Considereremo prima il caso in cui il gene viene espresso (cioè la proteina è sintetizzata) nell'ospite e, quindi, il caso piuttosto comune, in cui il gene non è espresso e si dovrà ricercare il DNA stesso.

Il gene esogeno è espresso nell'ospite

Se il gene esogeno viene espresso (cioè la proteina viene sintetizzata) nell'ospite, si possono sfruttare diversi approcci che evidenziano la presenza della proteina nei cloni ricombinanti. In questo caso l'ospite utilizzato non deve essere in grado di produrre la proteina in esame. Individuare i cloni che esprimono il gene significa cercare quelle poche colonie in cui la proteina è presente. Se l'ospite produce normalmente quella proteina, allora è necessario che sia difettivo, cioè presenti una mutazione in quel gene. In questo caso, quando avviene l'introduzione del gene esogeno, la sua espressione sarà evidenziata dalla complementazione. Ovviamente, se l'ospite esprime già una proteina con la medesima attività, risulta difficile evidenziare la proteina codificata dal gene esogeno. Se il prodotto del gene che si è clonato è una proteina eucariotica che l'ospite batterico normalmente non produce, allora quest'ultimo è naturalmente difettivo per quel gene. Un esempio singolare è il clonaggio in Escherichia coli del gene della luciferasi di coleotteri luminescenti; al buio i cloni appaiono di colori diversi a seconda del tipo di luciferasi presente.

Gli anticorpi come mezzo per l'identificazione di proteine

Quando le proteine non hanno una funzione facilmente identificabile, è necessario un approccio di tipo diverso. E` possibile utilizzare un anticorpo come reagente specifico nei confronti della proteina di interesse. La proteina di interesse è l'antigene e viene utilizzata per produrre un anticorpo in un animale da laboratorio. Poiché l'anticorpo si combina specificamente con l'antigene, se l'antigene è presente in una o più colonie della piastra può essere localizzato osservando il legame all'anticorpo. Poiché nelle colonie è presente solo una piccola quantità di proteina (antigene) che lega solo una piccola quantità di anticorpo, è necessario disporre di un metodo di identificazione dell'anticorpo legato estremamente sensibile. In pratica viene utilizzato un sistema radioattivo che permette di evidenziare l'anticorpo legato tramite autoradiografia, usando lastre per raggi X.

·La procedura di "replica plating" viene utilizzata per riprodurre su un filtro, sul quale verranno effettuate poi tutte le manipolazioni, una copia della piastra madre.

·Le colonie duplicate vengono parzialmente lisate per permettere il rilascio della proteina (antigene) di interesse.

·Si procede poi all'aggiunta dell'anticorpo e si lascia avvenire la reazione antigene‑anticorpo.

·Dopo il lavaggio dell'anticorpo non legato, si procede all'aggiunta dell'agente radioattivo che è specifico per l'anticorpo. Infine si pone sopra il filtro una lastra autoradiografica e si espone.

Se è presente una colonia radioattiva si osserverà sulla lastra, dopo il suo sviluppo, una piccola macchia. La localizzazione sulla lastra di questo segnale corrisponde sulla piastra madre alla colonia che produce la proteina. Questa colonia può quindi essere prelevata dalla piastra madre e messa in coltura.

Le sonde ad acidi nucleici: ricerca del gene

Supponiamo che nell'ospite in cui è avvenuto il clonaggio non ci sia espressione del gene o che non siano disponibili test o anticorpi per l'identificazione del prodotto genico. Come è possibile identificare la presenza del gene nelle colonie? L`approccio più adatto è quello di utilizzare una sonda ad acidi nucleici che contenga una porzione chiave della sequenza di basi del gene che interessa. L'ibridazione di un acido nucleico può essere sfruttata come strumento per individuare polinucleotidi con sequenze specifiche. Sia il DNA che l'RNA possono essere sfruttati come sonde. La procedura generale prevede l'ibridazione tra la sonda a singolo filamento, dopo che è stata marcata con fosforo radioattivo, e la singola elica derivata dal DNA clonato. A causa dell'estrema specificità di appaiamento delle basi, due sequenze nucleotidiche a singolo filamento ibridano solo se quasi completamente complementari . Usando opportune condizioni di ibridazione è possibile ottenere il legame della sonda radioattiva solo all'acido nucleico di interesse.

vettori di espressione

Per le applicazioni pratiche è essenziale disporre di un sistema in cui il gene clonato possa essere espresso. Gli organismi viventi posseggono complessi sistemi di regolazione e molti geni non sono sempre espressi. Uno degli obiettivi più importanti dell'ingegneria genetica è lo sviluppo di vettori in cui possa esserci un alto livello di espressione del gene.

Un vettore di espressione è il gene desiderato, ma che contiene anche le sequenze di regolazione necessarie perché l'espressione del gene sia mantenuta sotto il controllo del ricercatore.

Caratteristiche di un sistema di espressione efficiente Un vettore deve essere costruito in modo tale che siano mantenuti sotto controllo i fattori che influenzano il livello di espressione di un gene. Inoltre, si deve utilizzare un ospite nel quale quel vettore di espressione sia molto efficiente. Riassumiamo ora le caratteristiche essenziali di un sistema di espressione efficiente.

1. Numero di copie del gene per cellula. In generale, la quantità di proteina prodotta è maggiore quando nella cellula è presente un numero elevato di copie del gene. I vettori, come i plasmidi di piccole dimensioni (per esempio pBR322), sono molto utili perché possono replicarsi ad alto numero di copie. Talvolta, spesso a scopo di ricerca, è desiderabile avere una sola copia del gene clonato all'interno della cellula. Per questo motivo sono stati sviluppati vettori di integrazione per cui il gene può ricombinare all'interno del cromosoma dell'ospite.

2. Forza del promotore. La regione del promotore è il sito a cui si lega la RNA polimerasi. Promotori di geni diversi variano considerevolmente nella forza di legame alla RNA polimerasi. Per costruire un sistema che possa essere utile per le diverse applicazioni è necessario includere nel vettore di espressione un promotore forte. Nei batteri la regione di DNA localizzata a 10 e 35 nucleotidi prima del sito di inizio della trascrizione (chiamate regioni -10 e -35) sono estremamente importanti nel promotore. Molti geni di Escherichia coli sono controllati da un promotore relativamente debole e promotori provenienti da eucarioti o altri procarioti funzionano poco o nulla in questo microrganismo.

Un nuovo sistema di regolazione è stato costruito utilizzando il promotore e la RNA polimerasi del batteriofago T7. Quando T7 infetta E. coli, il fago codifica una RNA polimerasi in grado di riconoscere esclusivamente i promotori di T7, sospendendo l'attività di trascrizione dell'ospite. Nei vettori di espressione è possibile porre il frammento di DNA che si intende clonare sotto il controllo di un promotore di T7; se questo viene fatto, è necessario introdurre nel plasmide il gene per la RNA polimerasi di T7. Quest'ultimo viene posto sotto il controllo di un promotore facilmente regolabile come quello di lambda o di lac. Poco tempo dopo la trascrizione dell'RNA polimerasi di T7, si ha l'espressione dei geni clonati. Poiché questa RNA polimerasi riconosce solo i promotori di T7, trascrive solo i geni clonati, mentre tutti gli altri geni dell'ospite non vengono trascritti.

3. Presenza di un sito di legame al ribosoma batterico. L`mRNA trascritto deve legarsi fortemente al ribosoma perché possa avere inizio la traduzione e la parte iniziale del trascritto deve contenere la sequenza di legame al ribosoma (sequenza di Shine‑Dalgarno). Poiché i siti per il legame al ribosoma batterico non sono presenti nei geni eucariotici, è essenziale che questa regione sia introdotta nel frammento di DNA clonato se si desidera avere un alto livello di espressione del gene.

4. Una corretta fase di lettura. In alcuni casi il sito di legame al ribosoma e il codone di inizio del gene che deve essere clonato fanno parte del vettore di espressione. A seconda del meccanismo mediante il quale il DNA da clonare è fuso nel vettore si possono avere tre possibili fasi di lettura, una sola delle quali è appropriata. Se non si conosce la corretta fase di lettura, è possibile utilizzare tre diversi vettori ognuno con il sito di restrizione, in cui viene inserito il DNA da clonare, in posizione tale da generare differenti fasi di lettura. Il gene viene inserito nei tre vettori e viene selezionato quello che dà espressione appropriata.

5. Uso dei codoni. La maggior parte dei 20 aminoacidi è codificata da più di un codone e spesso alcuni sono usati più frequentemente di altri. La scelta dei codoni da utilizzare è in parte funzione della concentrazione del tRNA appropriato presente nella cellula. Un codone frequentemente usato in una cellula di mammifero può esserlo meno nell'organismo in cui il gene è stato clonato. L`inserimento del codone appropriato è difficile in quanto è un processo che andrebbe applicato a tutta la lunghezza del gene. Se necessario, questo può essere fatto utilizzando DNA sintetico o attraverso mutagenesi sito‑diretta per creare un gene che meglio risponde ai tipi di codoni utilizzati dall'ospite.

6. Destino della proteina dopo la sua produzione.

·Alcune proteine sono sensibili alla degradazione da parte di proteasi intracellulari e possono essere distrutte prima del loro isolamento.

·Le proteine di secrezione devono avere un`opportuna sequenza segnale per poter attraversare la membrana citoplasmatica.

· Alcune proteine eucariotiche sono tossiche per l'ospite procariotico che può essere ucciso prima che una sufficiente quantità di prodotto venga sintetizzata. Per eliminare questi problemi può essere necessaria un'ulteriore manipolazione sia dell'ospite che del vettore.

È quindi essenziale costruire vettori appropriati che possano essere (1) efficientemente introdotti in un ospite opportuno. (2) replicati ad alto numero di copie, (3) efficientemente trascritti e, (4) efficientemente tradotti. Molte proteine di mammifero non vengono espresse quando i loro geni sono clonati in E. coli, ma l'espressione può talvolta essere raggiunta con un'opportuna manipolazione del vettore. L`esempio migliore è dato dalla produzione su scala industriale dell'insulina umana in E. coli.

Il DNA sintetico

Sono disponibili diverse tecniche per la sintesi di brevi segmenti di DNA con una specifica sequenza di basi. Il DNA sintetico è ampiamente utilizzato nella genetica molecolare, soprattutto nell'ingegneria genetica, ma anche nella ricerca di base. Le procedure per la sintesi del DNA possono essere completamente automatizzate in modo tale che un oligonucleotide di 30‑35 basi può essere facilmente costruito in poche ore e, se necessario, possono essere prodotti oligonucleotidi di lunghezza superiore alle 100 basi. Per la sintesi di polinucleotidì più lunghi, i frammenti oligonucleotidici possono essere uniti enzimaticamente sfruttando la DNA ligasi.

USO: ·Le molecole di DNA sintetico sono largamente utilizzate come sonde in ingegneria genetica per identificare, attraverso ibridazione, specifiche sequenze di DNA.

· Infine, il DNA sintetico può essere ampiamente utilizzato nella costruzione di inneschi per la reazione a catena della polimerasi, detta PCR (vedi sotto).

Amplificazione del DNA: reazione a catena della polimerasi (PCR)

Per convenzione i sistemi di clonaggio genico vengono considerati mezzi di amplificazione del DNA in vivo. La tecnologia del DNA sintetico ha permesso lo sviluppo di un nuovo metodo, denominato reazione a catena della polimerasi (PCR, polymerase chain reaction), che permette una rapida amplificazione in vitro del DNA. Con la reazione a catena della polimerasi, è possibile amplificare in provetta molecole di DNA fino a un miliardo di volte, fornendo una grande quantità di specifici geni utilizzabili per il clonaggio, il sequenziamento o la mutagenesi.

La PCR impiega l'enzima DNA polímerasi per copiare le molecole di DNA.

La PCR richiede che sia nota la sequenza nucleotidica di una porzione del gene desiderato. Sono infatti necessarie, perché la PCR possa funzionare, brevi sequenze oligonucleotidiche, denominate inneschi, complementari a sequenze del gene o dei geni che devono essere amplificati.

I passaggi per l'amplificazione del DNA sono i seguenti:

(1) due inneschi fiancheggianti il DNA bersaglio (Figura b) vengono prodotti mediante un sintetizzatore di oligonucleotidi e aggiunti in grande eccesso al DNA bersaglio, denaturato mediante calore (Figura a).

(2) Quando la miscela viene raffreddata, l'eccesso di inneschi specifici per il DNA bersaglio assicura che la maggior parte dei filamenti bersaglio si leghi ad un innesco e non l'un l'altro (Figura b).

(3) Successivamente, viene aggiunta la DNA polimerasi che estende gli inneschi utilizzando come stampo il DNA bersaglio (Figura c).

(4) Dopo un appropriato tempo di incubazione, la miscela viene nuovamente scaldata per separare i due filamenti. La miscela viene quindi raffreddata per permettere agli inneschi di ibridare con le regioni complementari del DNA di nuova sintesi e l'intero processo viene ripetuto (Figura e).

Quindi, ciascun "ciclo" di PCR prevede i seguenti passaggi:

(1) denaturazione mediante calore della doppia elica del DNA bersaglio.

(2) abbassamento della temperatura per permettere l'ibridazione tra gli inneschi specifici e il DNA bersaglio, e

(3) 101PCR animation.gif (151337 bytes) estensione degli inneschi grazie all'azione della DNA polimerasi (Figura ). Si noti nella Figura come il prodotto di un ciclo di PCR possa servire come stampo per quello successivo. L`utilita` della PCR è legata al fatto che ciascun ciclo duplica la quantità di DNA bersaglio originale. In pratica si utilizzano 20‑30 cicli che permettono un incremento della sequenza bersaglio di 106‑109 volte .

Inizialmente la tecnica PCR sfruttava la DNA polimerasi di Escherichia coli che, a causa delle alte temperature necessarie per denaturare la doppia elica del DNA, veniva danneggiata e quindi ad ogni ciclo di reazione era richiesta l'aggiunta di nuova polimerasi. Questo, oltre ad essere molto costoso, tendeva a limitare il numero di cicli che poteva essere effettuato. Il problema è stato risolto con l'impiego di una DNA polimerasi termostabile isolata dal batterio termofilo denominato Thermus aquaticus. La DNA polimerasi dì questo organismo, conosciuta come Taq polimerasi, è stabile a 95 ºC e quindi non risente delle alte temperature impiegate nella PCR per la denaturazione della doppia elica del DNA. L`uso della Taq polimerasi aumenta inoltre la specificità della reazione della PCR perché il DNA viene copiato a 72 ºC e non a 37 ºC. Utilizzando la Taq polimerasi, invece dell'enzima di E. coli, il prodotto della PCR è molto più omogeneo in quanto, alle alte temperature, l'ibridazione degli inneschi con sequenze non specifiche si verifica molto più raramente.

Un problema legato all'utilizzazione della Taq polimerasi è la mancanza di attività esonucleasica per la correzione dei nucleotidi introdotti erroneamente, che determina una possibilità di errore maggiore rispetto all'enzima estratto da E. coli. Attualmente vengono sfruttate per la PCR DNA polimerasi estratte da Archebatteri marini ipertermofili, dotate di attività esonucleasica che controlla e corregge gli errori.

Poiché nella PCR sono necessari diversi passaggi ripetuti, sono stati sviluppati strumenti che possono essere programmati per lo svolgimento automatizzato di cicli di riscaldamento e raffreddamento. Poiché ciascun ciclo richiede mediamente solo cinque minuti, queste procedure automatizzate permettono una notevole amplificazione anche in poche ore (invece, la stessa amplificazione mediante metodi di clonaggio in vivo richiederebbe diversi giorni). Per sopperire alla notevole richiesta, il gene che codifica per la DNA polimerasi termostabile, impiegata nella PCR e nel sequenziamento del DNA, è stato clonato in E. coli e prodotto in grandi quantità; i costi della PCR sono quindi molto diminuiti rispetto a quelli che dovevano essere sostenuti quando la tecnica fu introdotta.

La PCR ha trovato molte applicazioni pratiche; è una tecnica molto utile in quanto:

(1) permette, prima del clonaggio, di amplificare con degli inneschi il gene o i geni di interesse, identificati tramite ibridazione.

(2) La PCR può essere estremamente utile anche per il sequenziamento del DNA in quanto produce grandi quantità di specifiche sequenze di DNA ed aumenta enormemente l'efficienza dei protocolli per il sequenziamento.

(3) La PCR può anche essere utilizzata per produrre grandi quantità di DNA mutato. Se sufficientemente lunghi, inneschi contenenti una o poche basi mutate si appaiano ancora al gene bersaglio permettendo l'amplificazione della mutazione introdotta (questa è una forma di mutagenesi sito‑diretta). Il DNA mutato può essere utilizzato per trasformare cellule e generare mutanti.

(4) Poiché gli inneschi utilizzati non devono essere perfettamente complementari, la PCR è usata per studi comparativi o evolutivi per isolare da diversi campioni geni già clonati (e sequenziati) da un organismo. In questi casi gli inneschi sono costruiti in modo tale da appaiarsi a regioni del gene che si pensa siano conservate in diversi organismi. Grazie alla sua sensibilità, la PCR è stata utilizzata per amplificare e clonare il DNA proveniente da fonti come resti umani mummificati e persino da campioni di animali e piante estinte.

(5) La PCR può essere utilizzata anche per amplificare quantità molto piccole di DNA presenti in un campione. Usando inneschi appropriati è possibile individuare una singola cellula batterica in un campione in cui sono presenti molte altre specie.

(6) La PCR è stata anche utilizzata per sviluppare il DNA "fingerprinting”, una potente tecnica che può permettere l'identificazione di individui o relazioni tra individui a partire da piccoli campioni del loro DNA.

Applicazioni pratiche dell’ingegneria genetica

Elenchiamo alcune delle principali applicazioni pratiche della tecnologia del DNA ricombinante che descriveremo in maggior dettaglio più avanti.

L`ingegneria genetica trova molte applicazioni sia pratiche che commerciali. Alcune delle principali aree di interesse commerciale sono:

1. Fermentazioni microbiche. Numerosi prodotti, soprattutto antibiotici, vengono prodotti industrialmente usando microrganismi. Le tecniche dell'ingegneria genetica possono essere sfruttate per manipolare gli organismi in grado di produrre antibiotici, al fine di aumentarne la resa o produrre molecole modificate.

2. Vaccini virali. (vedi anche qui) Un vaccino è un farmaco in grado di indurre immunità nei confronti di un agente infettivo. Frequentemente si utilizzano come vaccini preparazioni di virus uccisi, nei quali è però sempre insita la possibilità che il virus non sia stato completamente inattivato e quindi possono essere potenzialmente dannosi per il paziente. Poiché le proteine virali di superficie rappresentano la parte attiva del virus inattivato, è importante produrre queste proteine separatamente dal resto delle particelle virali. Mediante l'ingegneria genetica, i geni che codificano le proteine virali di superficie possono essere clonati ed espressi in un batterio o in un virus non patogeno con la produzione di vaccini sicuri e convenienti.

3. Proteine di mammifero. Numerose proteine di mammifero sono di grande interesse sia medico che commerciale. Nel caso delle proteine umane, la produzione commerciale attraverso il loro isolamento diretto da fluidi o tessuti è costoso e complicato o addirittura impossibile. Mediante il clonaggio del gene che codifica una proteina umana in un ospite procariotico, diventa possibile la sua produzione commerciale.

4. Piante e animali transgenici. Oltre alla produzione di molecole utili da parte dei microrganismi, l'ingegneria genetica permette di modificare geneticamente piante ed animali. Si ritiene che questi organismi, detti transgenici, possano essere molto utili per lo sviluppo delle attività agricole grazie alla possibilità di alterare la qualità nutrizionale di carni e vegetali, e di ottenere proteine che non vengono facilmente prodotte mediante microrganismi geneticamente manipolati. Introducendo il DNA clonato in uova fecondate o direttamente in cellule vegetali, è possibile produrre organismi superiori geneticamente modificati.

5. Biotecnologie ambientali. A causa dell'elevata diversità metabolica dei batteri è disponibile una grande varietà di geni dai microrganismi presenti in natura. In alcuni casi questi geni codificano enzimi in grado di degradare inquinanti ambientali. I geni coinvolti nella degradazione di molti composti tossici e inquinanti presenti nelle acque di scarico sono stati identificati in batteri isolati da ambienti naturali. L`ingegneria genetica sfrutta queste risorse per processi di decontaminazione ambientale. Spesso i geni utilizzati vengono isolati da ceppi batterici selezionati da siti contaminati; ad esempio i geni per la biodegradazione dei pesticidi clorurati, come l'acido 2,4,5triclorofenossiacetico (2,4,5‑T), clorobenzeni e clorofenoli, naftalene, toluene, aniline e diversi idrocarburi. Questi geni isolati soprattutto da batteri appartenenti ai generi Pseudomonas e Alcaligenes, vengono clonati in plasmidi. Sono stati costruiti plasmidi contenenti geni per la biodegradazione di diversi composti chimici tossici.

6. Regolazione e terapia genica. Il primo impiego dell'ingegneria genetica nelle biotecnologie industriali è stato quello che ha portato alla produzione di molecole utili con approcci più semplici e alla selezione di organismi transgenici. Come vedremo nelle prossime sezioni, questo tipo di approccio sta portando innovazioni utili. Tuttavia, molte delle ricerche sono ora rivolte alla creazione di nuovi prodotti e al controllo dell'espressione di geni specifici. La ricerca è diretta a produrre RNA antisenso e ribozimi che regolano l'espressione di specifici geni. (Molti studi sono diretti alla comprensione del meccanismo con cui queste molecole potrebbero essere introdotte in opportune cellule e tessuti). Un settore in cui le biotecnologie potrebbero rivelarsi fondamentali è quello relativo all'impiego dell'ingegneria genetica nella cura delle malattie genetiche.

Nonostante le eccitanti promesse dell'ingegneria genetica nelle biotecnologie, portare un prodotto sul mercato è un impresa enorme. Oltre agli ovvi problemi connessi con il corretto clonaggio ed espressione del gene nell'organismo prescelto, generalmente un batterio o un lievito, e la purificazione del prodotto desiderato. Devono essere prese in considerazione le prove cliniche e le autorizzazioni degli enti preposti al controllo delle molecole di nuova produzione. Qualsiasi prodotto sintetizzato in un microrganismo e destinato all'uomo deve essere sottoposto ad una serie di prove cliniche. Per esempio, l'insulina umana prodotta con la tecnologia del DNA ricombinante, nonostante sia del tutto identica a quella prodotta nell'uomo, è stata sottoposta a rigorosi controlli clinici condotti su volontari. Se le prove cliniche danno un risultato positivo, è possibile ottenere l'approvazione. negli Stati Uniti, da parte della Food and Drug Administration (FDA). Attualmente, centinaia di prodotti sono sottoposti a studi clinici e vicini all'approvazione finale per cui è prevedibile che nel prossimo decennio molti di questi composti saranno disponibili sul mercato. Consideriamo ora alcuni di questi prodotti.

Produzione di vaccini e di proteine di mammifero mediante microrganismi geneticamente modificati

Una delle applicazioni pratiche più significative dell'ingegneria genetica è la possibilità di produrre, in batteri facilmente coltivabili, proteine normalmente presenti in organismi più difficili o più costosi da crescere. Sebbene la DNA polimerasi originariamente utilizzata per lo sviluppo della reazione a catena della polimerasi (PCR) fosse estratta da batteri termofili, attualmente viene prodotta più facilmente in ceppi di E. coli in cui è stato introdotto il gene che la codifica. Anche molti enzimi di restrizione vengono prodotti mediante geni clonati in E. coli. Inoltre, molte proteine di interesse industriale non solo vengono prodotte in microrganismi, ma sono state anche modificate mediante la mutagenesi sito‑diretta. Un esempio è rappresentato da enzimi utilizzati nei detersivi: i geni codificanti questi enzimi vengono sistematicamente alterati per ottenere proteine meno sensibili alla denaturazione da candeggianti.

Molte proteine e peptidi di cellule di mammifero sono importanti da un punto di vista farmacologico. Tuttavia, poiché sono presenti nei tessuti in quantità estremamente ridotte, diventa molto costoso purificarle. Un altro impiego dell'ingegneria genetica è la produzione di queste proteine utilizzando i microrganismi. Un esempio di queste proteine e del loro uso è descritto nella Tabella.

Tabella. Alcuni importanti composti biotecnologici
prodotti con le tecniche del DNA ricombinante*
Prodotto	Funzione
Proteine del sangue
Attivatore del	Dissolve i trombi
plasminogeno tissutale
Fattori VII VIII, IX	Promuovono la coagulazione
Eritropoietina	Stimola la crescita degli eritrociti
Urochinasi	Dissolve i trombi
Ormoni
Insulina	Trattamento dei diabete
Ormone della crescita umano	Trattamento dei nanismo
Fattore di crescita	cicatrizzazione delle ferite
epidermico
Ormone paratiroideo	Regolazione del calcio
P-Endorfina	Antidolorifico
Fattore di crescita osseo	Osteoporosi
Atriopeptina	Diuretico, antipertensìvo
Immunomodulatori
Interferoni	Agenti antivirali e potenzialmente antitumorali
Interleuchina 2	Stimolatore dei linfociti T
Fattore di necrosi tumorale	Agente antitumorale
Fattore di stimolazione delle colonie di granulociti e macrofagi	Trattamento delle infezioni e del cancro
Lisozima	Antinfiammatorio
Voccini
Epatite B	Prevenzione delle epatiti da siero
Citomegalovirus	Prevenzione delle infezioni
Morbillo	Prevenzione dei morbillo
Colera	Prevenzione dei colera
AIDS	Prevenzione dell'AIDS
Rabbia	Prevenzione della rabbia
* Nonostante la ricerca stia facendo grandi progressi in ciascuno dei settori citati, non tutti i prodotti elencati sono già disponibili in commercio

In questo paragrafo descriveremo l'esempio dell'insulina e la produzione di vaccini virali mediante l'ingegneria genetica.

Ormoni

Molti ormoni sono peptidi o piccole proteine. Queste molecole sono estremamente importanti per il controllo del metabolismo dei mammiferi e trovano importanti applicazioni terapeutiche. Uno degli esempi più significativi del valore dell'ingegneria genetica in questo settore è rappresentato dalla produzione di insulina umana. L`insulina umana prodotta mediante ingegneria genetica è stata il primo "farmaco biotecnologico" ad essere immesso sul mercato. L`insulina, una proteina prodotta nel pancreas, è essenziale per la regolazione del metabolismo dei carboidrati. Il diabete, una patologia causata dalla carenza di insulina, affligge milioni di persone. Il trattamento standard del diabete prevede iniezioni o somministrazioni orali periodiche di insulina; poiché la struttura di questo ormone è simile in molti mammiferi, è possibile trattare il diabete somministrando insulina estratta dal pancreas bovino o suino. Tuttavia, l'isolamento di questa insulina, che è meno efficace di quella umana, è costoso e complesso. Si è quindi clonato il gene dell'insulina umana.

Produrre un ormone come l'insulina in un microrganismo íngegnerizzato comporta però problemi maggiori del semplice clonaggio di un gene (o cDNA) in un vettore di espressione. Questo è dovuto al fatto che molti ormoni sono solo piccoli frammenti del polipeptide codificato dal gene. L’insulina nella sua forma attiva è costituita da due polipeptidi (A e B) legati da ponti disolfuro. Questi due polipeptidi sono codificati da due porzioni distinte del gene dell'insulina. Il gene codifica la preproinsulina, un lungo polipeptide contenente una sequenza segnale (coinvolta nella secrezione della proteina), i polipeptidi A e B, che fanno parte della molecola attiva, e un peptide di unione assente nell'insulina matura. Dalla preproinsulina si forma la proinsulina che viene successivamente trasformata in insulina grazie al taglio enzimatico del polipeptide che unisce la catena A e B.

Sono stati utilizzati due approcci per ottenere la produzione di insulina umana nei batteri:

(1) produzione di proinsulina e sua conversione ad insulina tramite taglio chimico, e

(2) produzione in due colture batteriche distinte della catena A e B e loro giunzione chimica.

(2) Poiché l'insulina è una proteina di piccole dimensioni, è stato più conveniente sintetizzarne chimicamente il DNA invece di isolare il gene da tessuti umani. La catena A è codificata da 63 paia di basi, mentre la B da 90. Nella proinsulina ci sono 105 basi codificanti per il peptide che connette le catene A e B. All'estremità dei polinucleotidi sintetizzati sono stati inseriti siti di restrizione adeguati per l'inserimento nel plasmide pBR322. Per ottenere un'espressione efficiente, i geni sintetizzati sono stati inseriti in prossimità di un promotore di E. coli, come lac o trp, in modo tale che il frammento di insulina fosse sintetizzato come parte della b‑galattosidasi o della triptofano sintetasi, cioè come proteina di fusione. Un importante vantaggio nella produzione di una proteina di fusione è dato dalla sua maggiore stabilità in E. coli rispetto alla sola insulina. In particolare, la fusione con trp determina la formazione di una proteina insolubile che precipita, prevenendo l'azione delle proteasi di E. coli. Infine, nella regione di giunzione tra il gene lac o trp è stata introdotta una tripletta codificante per la metionina. Questo è stato fatto perché i residui di metionina vengono tagliati in modo specifico da un reagente chimico, il bromuro di cianogeno, che permette il recupero dell'insulina una volta che la proteina di fusione è stata isolata dal batterio. L’insulina, che non contiene residui di metionina, non viene alterata dall'azione del bromuro di cianogeno.La proinsulina isolata in questo modo dal batterio, viene convertita in insulina grazie alla formazione di legami disolfuro e alla rimozione enzimatica del peptide di giunzione. La proinsulina si ripiega naturalmente in modo tale che i residui cisteinici siano opposti l'uno all'altro, e il trattamento chimico determina la formazione di ponti disolfuro. Dopo la formazione del legame, il peptide di giunzione può essere rimosso mediante trattamento con la tripsina e con la carbossipeptidasi B, che non hanno effetto sull'insulina.

(1) Invece, quando l'insulina viene prodotta attraverso la sintesi separata dei due peptidi, ciascuna proteina di fusione viene isolata da colture batteriche diverse e i due peptidi vengono rilasciati dopo trattamento con bromuro di cianogeno. Le due catene tagliate vengono unite mediante un trattamento chimico che determina la formazione di ponti disolfuro. In condizioni appropriate è possibile ottenere una resa che è almeno il 60% di quella teorica.

Il prodotto finale, l'insulina umana biosintetica, è del tutto identica a quella purificata dal pancreas e può essere quindi commercializzata.

La produzione di insulina ha aperto la via alla produzione biotecnologica degli ormoni. L`insulina umana così prodotta è più economica e persino più efficace di quella bovina o suina, le due maggiori fonti prima dell'avvento delle biotecnologie. Altri importanti ormoni prodotti con la tecnologia del DNA ricombinante sono l'ormone della crescita umano, per il trattamento del nanismo, il fattore di crescita epidermico, per favorire la cicatrizzazione delle ferite, il fattore di crescita osseo, per il trattamento dell'osteoporosi, e gli ormoni della crescita animali per stimolare la crescita degli animali allo scopo di ridurre i costi per l'alimentazione e i tempi di commercializzazione.

Vaccini virali

I vaccini sono preparazioni di microrganismi patogeni uccisi o modificati, o specifiche frazioni di essi, che vengono iniettati in un animale per produrre l'immunità nei confronti di una determinata malattia. Generalmente, per produrre un vaccino, vengono clonati i geni codificanti le proteine del rivestimento dato che provocano una grande produzione anticorpale. L`importanza dei vaccini ricombinanti risiede naturalmente nel fatto che possono sostituire le sospensioni di virus uccisi o inattivati.

L`ingegneria genetica ha permesso di sviluppare con notevole successo alcuni vaccini a subunità. Questi vaccini contengono solo una subunità specifica di una proteina dell'organismo patogeno (generalmente una proteina del rivestimento); con le tecniche del DNA ricombinante è possibile ottenere microrganismi in grado di produrre queste subunità. Le proteine del rivestimento, che sono altamente immunogene, vengono purificate ed utilizzate a dosaggi elevati per permettere l'induzione di un livello protettivo di immunità. I passaggi per il clonaggio dei geni virali sono quelli riportati nelle precedenti sezioni: frammentazione del DNA virale mediante enzimi di restrizione; clonaggio del gene codificante la proteina del rivestimento in un opportuno vettore; ricerca del promotore, della fase di lettura e del sito di legame al ribosoma appropriati; inserimento ed espressione dei geni virali in un microrganismo. Sfortunatamente, quando E. coli viene utilizzato come ospite di clonaggio, i vaccini prodotti sono spesso scarsamente immunogeni e non sono in grado di proteggere il soggetto da una successiva infezione con il virus. Il problema deriva dal fatto che, quando il virus si replica nell'ospite, molte proteine virali del rivestimento subiscono delle modificazioni post‑traduzionali, generalmente l'aggiunta di residui di zuccheri (glicosilazioni). Le proteine ricombinanti prodotte da E. coli e da altri batteri non sono glicosilate ed evidentemente la glicosilazione è necessaria perché le proteine siano immunologicamente attive; quindi diventa opportuno utilizzare ospiti eucariotici.

Il primo vaccino ricombinante a subunità approvato per l'uso nell'uomo è stato prodotto in lievito. Un gene codificante per una proteina di superficie del virus dell'epatite B è stato clonato in lievito in un vettore di espressione ad alto numero di copie. La proteina prodotta forma aggregati molto simili a quelli presenti in pazienti infettati con il virus. Questi aggregati sono stati purificati ed utilizzati per la vaccinazione contro il virus dell'epatite B. Usando le tecniche dell'ingegneria genetica, sono stati sviluppati diversi vaccini a subunità contro una grande varietà di virus e organismi patogeni. Oltre al lievito vengono utilizzati, come ospiti, cellule di insetto e anche di mammifero. Per ottenere glicosilazione e altre modificazioni della proteina è spesso necessario usare un ospite strettamente correlato con l'uomo.

In molti laboratori si sta cercando di produrre un vaccino a subunità diretto contro il virus responsabile dell'AIDS (human immunodeficiency virus, o HIV). A causa delle gravi patologie correlate con l'AIDS, un vaccino sicuro ed efficace potrebbe trovare un mercato enorme. Il virus dell'HIV possiede diverse proteine di rivestimento, i cui geni sono stati clonati o costruiti ed espressi usando diversi vettori in ospiti differenti. Uno dei vettori utilizzati per il clonaggio in cellule di mammifero è il virus del vaiolo bovino.

Il clonaggio viene fatto utilizzando un plasmide di E. coli contenente un frammento del gene virale per la timidina chinasi. Dopo l'inserimento di un appropriato frammento di DNA esogeno in questo vettore, il plasmide ricombinante viene incubato in presenza del DNA del virus del vaiolo bovino "wild‑type". Se avviene ricombinazione omologa tra il DNA plasmidico e quello genomico del virus , si possono ottenere virioni ricombinanti che contengono solo parte del gene della timidina chinasi. I virioni ricombinanti sono portatori della forma inattiva del gene della timidina chinasi e poiché la timidina chinasi viene inibita dalla 5‑bromodeossiuridina, i virioni ricombinanti possono essere selezionati in quanto la replicazione virale può avvenire in presenza di questo inibitore. Sebbene questi ricombinanti non possano esprimere la timidina chinasi sono ancora in grado di infettare cellule umane permettendo l'espressione dei geni clonati. Alcuni virus ricombinanti sono in grado di contenere geni provenienti da quattro virus diversi!

Il virus del vaiolo bovino non è generalmente patogeno per l'uomo (originariamente era utilizzato come vaccino antivaiolo). Tuttavia, non è completamente esente da rischi (in alcuni soggetti si possono avere effetti collaterali anche gravi), e quindi devono essere fatti molti studi prima che questi vaccini possano essere utilizzati nell'uomo.

I vaccini costruiti con le tecniche dell'ingegneria genetica sono destinati ad avere un grosso successo poiché (1) sono più sicuri dei normali vaccini costituiti da virus uccisi o attenuati. (2) sono più riproducibili in quanto il loro patrimonio genetico può essere attentamente controllato, e (3) possono essere somministrati in dosi elevate senza effetti collaterali.

Altre proteine e prodotti ottenuti con la tecnologia del DNA ricombinante.

Oltre agli ormoni e ai vaccini, sono elencate altre proteine di mammifero. Alcune sono coinvolte nella coagulazione e in altri processi mediati dal sangue. Ricordiamo l'attivatore del plasminogeno tissutale e i fattori VII, VIII e IX della coagulazione. L`attivatore del plasminogeno tissutale (TPA) è una proteina presente nel sangue che agisce eliminando e dissolvendo i coaguli sanguigni nella fase finale del processo di cicatrizzazione. L`impiego del TPA riguarda soprattutto il trattamento dei cardiopatici e di quei soggetti in cui la circolazione risulta alterata dalla presenza di trombi. Il TPA può essere somministrato in seguito a "bypass" cardiaci, trapianti o altre operazioni a cuore aperto, al fine di prevenire lo sviluppo di embolie polmonari che sono spesso una minaccia per la sopravvivenza. Poiché le malattie cardiache sono una delle principali cause di morte in molti paesi sviluppati, si pensa che in futuro ci sarà una richiesta sempre maggiore di TPA.

Contrariamente al TPA, i fattori VII, VII e IX della coagulazione sono importanti per la formazione dei coaguli sanguigni. Gli emofilici che soffrono della mancanza di uno o più fattori della coagulazione, possono essere facilmente trattati con i prodotti ottenuti con le tecniche del DNA ricombinante. L`importanza dei fattori della coagulazione così prodotti, può essere compresa considerando che in passato gli emofilici venivano trattati con concentrati di questi fattori estratti dal sangue di donatori, alcuni rivelatisi poi affetti dal virus HIV. Gli emofilici sono quindi diventati una categoria ad alto rischio per l'infezione da HIV. Un`altra proteina del sangue di elevato interesse biotecnologico è l'eritropoietina che stimola la produzione degli eritrociti. Studi clinici hanno rivelato l'importanza di questa proteina nella cura delle anemie.

Diverse proteine hanno un importante ruolo come agenti antitumorali ed immunomodulatori. Gli interferoni sono proteine prodotte dalle cellule animali o in risposta ad un'infezione virale o in seguito ad attivazione immunitaria. L`interferone alfa in particolare può essere utile come agente antitumorale. Il trattamento con interferone alfa di alcune linee cellulari tumorali induce la cellula ad esprimere alcuni specifici antigeni associati al tumore. Questo fenomeno può essere di grande aiuto nel trattamento dei tumori in quanto la somministrazione di anticorpi monoclonali specifici diretti contro antigeni tumorali, dopo trattamento con interferone alfa, permette di veicolare farmaci al tumore. L`interleuchina‑2 è una proteina che stimola la proliferazione e il differenziamento dei linfociti T. Questa proteina, insieme al fattore di necrosi tumorale e al fattore di stimolazione di granulociti e macrofagi, potrebbe essere impiegata nel trattamento di alcune forme tumorali, in quanto possiede la capacità di stimolare la risposta immunitaria nei confronti di cellule tumorali.

Anche gli anticorpi monoclonali possono ora essere prodotti dai microrganismi sfruttando le tecniche dell'ingegneria genetica. La prima generazione di prodotti ottenuti con le tecniche del DNA ricombinante sono state le proteine ed è possibile fare ancora molto in questa direzione. Sono possibili altre applicazioni attraverso la mutagenesi sito‑diretta di geni clonati per ottenere nuovi prodotti con caratteristiche diverse. E` bene ricordare che molecole come gli antibiotici vengono sintetizzate nella cellula attraverso vie biochimiche che sfruttano una serie di enzimi (proteine). Questi enzimi possono essere modificati per produrre nuovi antibiotici.

Ingegneria genetica applicata all'agricoltura

Il tentativo di migliorare gli organismi vegetali con tecniche di genetica classica si è rivelato sempre piuttosto arduo, fino all'avvento della tecnologia del DNA ricombinante che promette cambiamenti rivoluzionari. E` possibíle sfruttare colture di tessuti vegetali per selezionare cloni di cellule geneticamente alterate e, dopo opportuni trattamenti indurre queste colture cellulari a rigenerare l'intera pianta che può essere propagata vegetativamente o attraverso i semi. La tecnologia del DNA ricombinante permette queste modificazioni in quanto è possibile la trasformazione di cellule vegetali introducendo DNA libero mediante elettroporazione o con il metodo dei microproiettili o inserendo il DNA esogeno direttamente utilizzando Agrobacteriurn tumefaciens. Questo organismo, che causa una malattia denominata galla del colletto trasferendo alla pianta geni specifici, può essere utilizzato come sistema di trasformazione naturale per introdurre DNA esogeno nelle piante.

Vettori per il clonaggio in cellule vegetali

Il microrganismo Gram‑negativo A. tumefaciens, patogeno delle piante, contiene un grosso plasmide denominato plasmide Ti che è responsabile della sua virulenza. Il plasmide Ti contiene geni in grado di mobilizzare DNA e trasferirlo alla pianta. Il frammento del plasmide Ti che effettivamente viene trasferito alla pianta è denominato T‑DNA. Le sequenze all'estremità del T‑DNA sono essenziali per il trasferimento e il DNA per poter essere trasferito deve essere compreso tra queste sequenze. Un tipo di vettore utilizzato per il trasferimento genico in cellule vegetali è chiamato vettore binario. Il termine binario significa costituito da due parti ed un vettore binario deve sempre essere utilizzato associato ad un altro plasmide perché il gene clonato sia trasferito alla pianta. Il vettore contiene le due estremità terminali del T‑DNA ai lati del sito di clonaggìo e un marcatore di resistenza ad un antibiotico selezionabile nella pianta. Inoltre il plasmide contiene un origine di replicazione che gli permette di replicarsi sia in A. tumefaciens che in Escheríchia coli (quest'ultímo serve come ospite per il lavoro di clonaggio), e un altro

marcatore per la resistenza a un antibiotico espresso nei batteri. Il DNA che deve essere clonato viene inserito nel vettore con cui viene poi trasformato E. coli. Successivamente viene trasferito in A. tumefaciens (generalmente attraverso coniugazione). Il successivo trasferimento alla pianta avviene grazie all'A. tumefaciens che contiene il plasmide Ti, in quanto il vettore non contiene i geni necessari per il trasferimento del T‑DNA. Il DNA clonato e il marcatore per la resistenza alla kanamicina possono essere mobilizzati dal plasmide Ti e trasferiti nella cellula vegetale (il plasmide Ti utilizzato è stato geneticamente modificato per prevenire l'insorgenza della malattia nella pianta). In seguito alla ricombinazione con il cromosoma, il DNA esogeno può essere espresso e conferire nuove proprietà alla pianta. Molti geni vengono espressi efficientemente nelle piante se clonati in un vettore di espressione che contiene un promotore vegetale. Promotori utilizzati nella costruzione di vettori di espressione per cellule vegetali sono quelli normalmente presenti nel T‑DNA e in un virus denominato virus del mosaico del cavolfiore, un virus a DNA che infetta le piante.

Mediante A. tumefaciens sono state prodotte molte piante transgeniche. I maggiori successi sono stati ottenuti con piante erbacee (dicotiledoni) come il pomodoro, la patata, il tabacco, la soia, l'erba medica, il cotone, e la lattuga; tuttavia è stato utilizzato anche per produrre piante transgeniche legnose come il pioppo, il noce e il melo. Piante transgeniche della famiglia delle graminacee (monocotiledoni) sono difficili da ottenere utilizzando A. tumefaciens, ma possono essere sfruttati altri metodi per l'introduzione del DNA, come l'elettroporazione o l'uso di microproiettili. Inoltre, sono stati sviluppati altri vettori modificando alcuni virus che infettano le piante, anche se non si sono rivelati così utili come quelli derivati dal plasmide Ti.

Applicazioni nelle biotecnologie vegetali

Una delle aree più significative per il miglioramento genetico delle piante include la resistenza agli erbicidi, agli insetti e ai microrganismi patogeni. La resistenza agli erbicidi può essere ottenuta modificando geneticamente le piante coltivate affinché non siano sensibili all'azione di composti tossici. Molti erbicidi inibiscono un enzima chiave o una proteina necessaria per la crescita della pianta. Ad esempio, il glifosato uccide la pianta inibendo l'attività di un enzima necessario per la sintesi degli aminoacidi aromatici. Un erbicida di questo tipo agisce ovviamente sia sull'infestante che sulla pianta coltivata, quindi può essere usato solo prima che la pianta sia emersa dal terreno. Tuttavia si sono ottenuti, mediante le tecniche standard di genetica, ceppi di Salmonella, un batterio Gram‑negativo, resistenti al glifosato (il glifosato inibisce anche l'enzima batterico). Questi geni sono stati poi trasferiti alla pianta usando il plasmide Ti come vettore. Quando sono trattate con il glifosato, le piante contenenti il gene batterico crescono come quelle di controllo non trattate.

In alcune piante sono state introdotte caratteristiche nuove di resistenza agli insetti. Una delle più promettenti applicazioni è l'introduzione di un gene di Bacillus thuringiensis codificante una tossina di natura proteica. Questo organismo produce una proteina denominata tossina Bt che è tossica per tignole e larve di lepidotteri. Alcuni ceppi producono inoltre altre proteine tossiche per coleotteri e larve di ditteri. I biotecnologi stanno tentando differenti approcci per aumentare l'uso della tossina Bt nella lotta agli insetti dannosi.

-Un possibile approccio è quello di sviluppare una tossina Bt tossica nei confronti di diversi insetti. Questo può essere fatto poiché la proteina possiede diversi domini distinti per la sua specificità e le sue funzioni tossiche. Il dominio che conferisce la tossicità è altamente conservato in tutte le tossine Bt. I ricercatori stanno tentando di produrre un gene che possa codificare una tossina Bt con un dominio tossico e più domini che conferiscono diversa specificità d'ospite. Una tossina di questo genere potrebbe essere applicata direttamente a diverse piante.

-Un altro approccio potrebbe essere quello di trasferire il gene a batteri (non patogeni) che normalmente vivono nei tessuti delle piante ed avere la produzione della tossina da parte dei batteri in questi tessuti.

-Un approccio sicuramente più efficace è quello di inserire il gene direttamente nel genoma della pianta.

Questo è già stato fatto con piante come il cotone, la patata, il pomodoro che hanno mostrato un aumento della resistenza alle larve che attaccano le piante di controllo.

Sono stati descritti casi di insetti che hanno sviluppato la resistenza alla tossina Bt. La resistenza agli insetticidi e agli erbicidi è un grosso problema in agricoltura e il fatto che una molecola sia stata prodotta con le tecniche del DNA ricombinante non assicura certo la sua soluzione. Questo evidenzia come siano necessari diversi approcci nella lotta contro gli insetti, di cui la tossina Bt è solo uno dei molti esempi sviluppati dal biotecnologi.

L`ingegneria genetica viene utilizzata anche per garantire alle piante la protezione dalle infezioni virali. E` stato osservato ad esempio che piante transgeniche, che esprimono un gene che codifica una proteina di rivestimento di un virus, risultano resistenti all'infezione da parte di quel virus. Sebbene il meccanismo di resistenza non sia conosciuto, la presenza di una proteina virale di rivestimento nelle cellule vegetali interferisce evidentemente con la formazione di particelle virali contenenti tale proteina, interrompendo il ciclo di replicazione del virus.

L`ingegneria genetica può essere sfruttata non solo per la selezione di piante resistenti alle malattie, ma anche per la costruzione di piante con caratteristiche particolari, quale ad esempio la produzione di un frutto più difficilmente deteriorabile. Inoltre, piante transgeniche possono essere geneticamente manipolate, come i microrganismi e gli animali, per ottenere prodotti commerciali o farmaceutici utili. Piante coltivate, come il tabacco e i pomodori, sono state modificate per ottenere diversi prodotti, come l'interferone umano o l'alfa‑amilasi batterica utilizzata nell'industria alimentare per la degradazione dell'amido. Le piante transgeniche possono essere utilizzate anche per produrre anticorpi animali in grosse quantità (tali anticorpi prodotti da piante sono a volte chiamati "pianticorpi") e persino granuli di poliestere utilizzati nell'industria della plastica.

Le piante sono ospiti utili per la produzione di questi tipi di composti in quanto sono in grado di modificare correttamente le proteine e possono essere cresciute e raccolte con facilità. Il futuro delle biotecnologie in campo vegetale è estremamente stimolante. Oltre alle caratteristiche discusse sopra, si stanno anche studiando sistemi per migliorare la resistenza delle piante a condizioni di siccità e salinità elevate. La tecnologia del DNA ricombinante ha offerto inoltre ai ricercatori potenti mezzi per lo studio dell'espressione genica nelle piante.

Ingegneria genetica applicata alla genetica umana e animale

In questo paragrafo verranno accennate solo brevemente alcune delle possibili applicazioni della tecnologia del DNA ricombinante nella genetica animale ed umana. Alcune di queste applicazioni riguardano la produzione di molecole utili, mentre altre sono correlate alla comprensione del funzionamento dei geni in mammifero e alla cura delle malattie genetiche.

Animali transgenici

Utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante e le tecniche di microiniezione per inserire geni clonati nelle uova fecondate, è stato possibile far esprimere diversi geni esogeni sia in animali da laboratorio sia in specie importanti per l'industria. Gli animali transgenici si sono rivelati estremamente utili nella ricerca biomedica di base per lo studio della regolazione genica e della biologia dello sviluppo. Inoltre, gli animali transgenici si sono dimostrati importanti anche per molti altri scopi applicativi.

Un obiettivo, come nel caso delle piante, è quello di aumentare, anche negli animali, la produttività o la resistenza alle malattie. Tuttavia, gli animali transgenici vengono anche utilizzati per produrre proteine di interesse farmacologico. Gli animali transgenici si rivelano utili per la produzione di proteine umane, come alcuni enzimi della coagulazione, che devono subire modificazioni post‑traduzionali per essere attivi; molte proteine di questo tipo non vengono prodotte dai microrganismi nella forma attiva. Inoltre, alcune proteine sono state modificate per poter essere secrete nel latte animale e quindi raccolte e purificate facilmente. Queste proteine includono l'alfa‑ 1 ‑antitripsina (usata nella cura di malattie polmonari) prodotta nella pecora e l'attivatore del plasminogeno tissutale (utilizzato per dissolvere i trombi) prodotto nella capra. Maiali transgenici sono stati modificati per produrre grandi quantità di emoglobina umana. Questa emoglobina può essere facilmente isolata, purificata ed utilizzata come sostituente del sangue. La produzione di animali transgenici per la ricerca e a scopi commerciali continuerà ad essere un importante settore delle biotecnologie. Mediante le tecniche di microiniezione, l'uso di SV40 o di retrovirus utilizzati per introdurre DNA esogeno negli embrioni, è possibile ottenere animali transgenici da polli, mucche, pesci, maiali, conigli e pecore.

Genetica umana

Tutti gli esperimenti di genetica convenzionale, che richiedono incroci genetici e mutagenesi, non possono essere fatti direttamente nell'uomo. Quindi, nonostante l'ovvio interesse, le nostre conoscenze di genetica umana sono notevolmente meno approfondite rispetto alla genetica di molti altri organismi. L’avvento dell'ingegneria genetica ha chiaramente rivoluzionato le ricerche sul genoma umano. Una discussione dettagliata sulla genetica umana esula dagli scopi di questo corso, tuttavia è necessario ricordare alcuni dati generali sull'utilità della tecnologia del DNA ricombinante in questo settore. Abbiamo già ricordato l'impiego della PCR nel DNA "fingerprinting" e gli sforzi considerevoli che si stanno facendo per clonare e sequenziare l'intero genoma umano.

Alcune applicazioni dell'ingegneria genetica sono rivolte al trattamento delle malattie genetiche. Sono note numerose malattie genetiche ma, salvo qualche rara eccezione, le conoscenze delle basi molecolari di molte di queste malattie sono scarse. Utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante e le tecniche di genetica convenzionale (studio dell'ereditarietà familiare, ecc.) è possibile localizzare difetti genetici in particolari cromosomi e in siti particolari dei cromosomi. Con la tecnologia del DNA ricombinante è possibile clonare la regione contenente il difetto genetico e confrontare la sequenza delle basi del gene normale con quella del cromosoma geneticamente alterato. Da studi di questo tipo, è stato possibile ottenere informazioni sulle mutazioni genetiche anche in assenza di informazioni sul difetto enzimatico. Molti geni, inclusi quelli responsabili della malattia di Huntington, la fibrosi cistica, la distrofia muscolare di Duchenne, sono stati localizzati utilizzando queste tecniche.

L`ingegneria genetica ha permesso di sviluppare terapie geniche per la cura di alcune di queste malattie. Nella terapia genica un gene non funzionante o malfunzionante viene affiancato o sostituito da uno funzionante. Non tutte le malattie genetiche possono essere trattate mediante la terapia genica; molti sforzi sono stati fatti per individuare protocolli per la cura dei tumori. Gli ostacoli maggiori per questo tipo di approccio sono essenzialmente due: (1) l'individuazione della corretta cellula bersaglio per la terapia genica e (2) la trasfezione di linee cellulari che perpetueranno l'alterazione genetica.

La prima malattia in cui è stata utilizzata una terapia genica è stata una immunodeficienza combinata grave, causata dall'assenza dell'adenosina deaminasi (ADA, un enzima coinvolto nel metabolismo delle purine) nelle cellule del midollo osseo. La terapia prevede l'utilizzo di un retrovirus come vettore per l'inserimento di una copia funzionante del gene ADA nei linfociti T (cellule che fanno parte del sistema immunitario) rimossi dal paziente e successivamente reintrodotti dopo modificazione (il retrovirus porta anche un gene che conferisce resistenza alla neomicina, in modo tale che le cellule recanti il retrovirus inserito possano essere selezionate e identificate). Poiché i linfociti T hanno una vita breve, è necessario ripetere la terapia ogni uno o due mesi. Sono stati fatti dei tentativi per inserire Il gene nelle cellule staminali del midollo osseo (che continuano a dividersi) e trovare così, una cura efficace per questa malattia. Molti altri tentativi di terapia genica, che sfruttano vettori virali diversi, sono attualmente in via di sviluppo. E` importante notare che in tutti i protocolli sotto studio il gene difettoso non viene mai rimpiazzato, ma piuttosto il retrovirus (contenente la copia funzionante del gene) si integra semplicemente nel genoma di questa cellula. La effettiva sostituzione del gene nelle cellule della linea germinale (cellule che daranno quindi vita ai gameti) può essere effettuata in alcuni mammiferi, sebbene le tecniche utilizzate per l'isolamento degli animali con queste modificazioni non possano essere facilmente applicate all'uomo. In ogni caso il tentativo di modificare la linea germinale di un individuo crea, oltre ai normali problemi di protocollo sperimentale, degli interrogativi di tipo etico e sociale.

Ingengeria genetica per lo studio dei microrganismi

Il clonaggio dei geni e la costruzione di nuovi ceppi ingegnerizzati sono dei mezzi per comprendere i processi microbiologici di base, come la relazione struttura‑funzione, la crescita cellulare, la regolazione enzimatica e l'ecologia microbica. Si possono costruire ceppi microbici che differiscono in maniera determinata dal ceppo "wild‑type" e studiarne i processi sottesi. In questo modo, in condizioni attentamente controllate, è possibile stabilire l'importanza di un particolare prodotto genico per un processo microbico di base. Il clonaggio dei geni, la mappatura tramite restrizione e il sequenziamento permettono ai ricercatori di mappare rapidamente e studiare il genoma di organismi di nuova identificazione.

I geni clonati possano essere sottoposti a mutagenesi sito‑diretta o mutagenesi a cassetta. Questi geni mutati possono poi essere introdotti nel cromosoma batterico per lo studio del microrganismo modificato. L`ingegneria genetica permette al ricercatore anche di marcare un gene in modo tale da renderne più facile lo studio. Per esempio, quando il prodotto di un gene è difficile da saggiare o non ha una funzione nota, è spesso difficile conoscere in quali condizioni la cellula produca la proteina. E` possibile sfruttare questa tecnica anche per marcare l'organismo stesso in modo da poterlo seguire nell'ambiente.

In questi casi un gene o il suo promotore possono essere fusi con un gene reporter. I geni "reporter" sono facili da saggiare, come ad esempio la b‑galattosidasi (la cui attività può essere identificata su una piastra con un indicatore o saggiata facilmente con valutazioni biochimiche), comunemente usata come gene "reporter". Esistono tuttavia altre possibilità, per esempio, Escherichia coli è stato manipolato in modo tale da produrre l'enzima luciferasi del batterio Photobacterium o quello di altri coleotteri luminescenti. E. coli geneticamente modificato diventa luminescente per la presenza di questo enzima e le sue colonie al buio appaiono luminose. In questo modo è possibile identificare le colonie di E. coli ingegnerizzato in mezzo ad una grande varietà di altre colonie. Questo sistema può essere sfruttato per molti altri microrganismi geneticamente modificati.

Un altro sistema per seguire le tracce di un organismo nell'ambiente è quello di introdurvi il gene per la b‑galattosidasi ed utilizzare un terreno di coltura con un indicatore particolare che permette l'identificazione delle colonie che producono l'enzima. Un esempio di questo approccio è l'introduzione del gene codificante la b‑galattosidasi nel batterio Pseudomonas_fluorescens, un microrganismo del suolo incapace di metabolizzare il lattosio, questo gene funge da marcatore per seguire le tracce di ceppi ingegnerizzati rilasciati nell'ambiente.