Autore Bruno Pacifici

Diversità metabolica nei microrganismi

Gli organismi di cui ci occuperemo ora sono tra i più diffusi e più importanti sulla Terra. Come vedremo, nella biosfera essi svolgono funzioni essenziali e sono di grande importanza sia nell'agricoltura che in altre attività antropiche.

Metabolismo energetico

Fotosintesi

Ruolo della clorofilla e della batterioclorofilla nella fotosintesi

Fotosintesi anossigenica

Fotosintesi ossigenica

Ulteriori aspetti delle reazioni alla luce

Fissazione autotrofa della CO2

Chemiolitotrofi: energia dall’ossidazione di composti inorganici

Idrogenobatteri

Solfobatteri

Ferrobatteri

Batteri ammonio- e nitrito-ossidanti

Autotrofia e produzione di ATP nei chemiolitotrofi

Respirazione anaerobica

Riduzione del nitrato e denitrificazione

Riduzione del solfato

L’anidride carbonica come accettore di elettroni

Altri accettori di elettroni nella respirazione anaerobica

Fermentazioni

Il metabolismo dell’azoto

La fissazione dell’azoto

Metabolismo energetico

I microrganísmi presentano una notevole diversità nei processi metabolici. In questo capitolo continueremo la discussione sul metabolismo microbico già iniziata precedentemente. La Figura riassume i tipi fondamentali di metabolismo energetico ed elenca alcuni dei termini utilizzati.

Come abbiamo già visto, si possono riconoscere due tipi di metabolismo energetico: un metabolismo in cui la fonte di energia è di tipo chimico e un metabolismo in cui la fonte di energia è la luce. Molti microrganismi, analogamente all'uomo e agli animali, utilizzano composti organici come fonte di energia. Questi organismi vengono definiti chemiorganotrofi. Al contrario, un interessante gruppo di microrganismi costituito esclusivamente da procarioti, definiti chemiolitotrofi utilizza composti inorganici come fonte di energia.

Un'ampia classe di organismi viventi, chiamati fototrofi, utilizza la luce come fonte di energia. I fototrofi includono, naturalmente, le piante verdi, ma anche molti microrganismi, sia procariotici che eucariotici.

Sono noti due tipi diversi di fotosintesi, quella tipica delle piante verdi ma presente anche in alcuni microrganismi eucariotici e procariotici, e quella caratteristica di un gruppo particolare di batteri, i batteri rossi e verdi.

Gli organismi che sfruttano i composti inorganici o la luce come fonte di energia sono spesso in grado di crescere in completa assenza di composti organici, utilizzando l'anidride carbonica come unica fonte di carbonio. Il termine autotrofo (che significa, letteralmente, che si nutre da sè) viene utilizzato per indicare quei microrganismi in grado di ricavare tutto il carbonio di cui necessitano da una fonte inorganica. Si noti che il termine autotrofia si riferisce alla fonte di carbonio utilizzata e non a quella energetica. Gli autotrofi sono di grande importanza nella biosfera in quanto sono in grado di sintetizzare materiale organico a partire da una fonte inorganica. Poiché l'uomo e gli animali richiedono per sopravvivere una fonte di carbonio organico, e per questa ragione vengono chiamati eterotrofi, la vita nella biosfera dipende dalla collettività degli organismi autotrofi.

In questo capitolo utilizzeremo il concetto di ossido-riduzione ed in particolar modo i termini accettore di elettroni, donatore di elettroni e trasporto degli elettroni.

Oltre ad occuparci di alcuni tipi di metabolismo energetico alternativo, discuteremo alcuni aspetti particolari del catabolismo che in precedenza abbiamo considerato rapidamente. Per esempio, la discussione sul metabolismo respiratorio, focalizzata soprattutto sull'O₂ come accettore di elettroni, verrà ampliata considerando l'esistenza di altri accettori di elettroni che possono partecipare al trasporto degli elettroni in particolari gruppi di microrganismi. Il processo, in cui viene usato un accettore di elettroni diverso dall'ossigeno molecolare, viene definito respirazione anaerobica e rappresenta una delle principali caratteristiche della diversità metabolica discussa in questo capitolo.

Inoltre, la discussione sul metabolismo di composti organici, che è stata focalizzata soprattutto sull'utilizzo dei glucosio e degli zuccheri ad esso correlati, verrà ampliata considerando molti altri composti organici che fungono da fonte di energia per gli organismi chemiorganotrofi. L’utilizzo di questi composti organici "insoliti" non è solo di interesse biochimico, ma anche applicativo, come vedremo discutendo la microbiologia del petrolio, il trattamento delle acque di scarico e la biodegradazione.

Infine, sebbene l'argomento principale di questo capitolo sia il metabolismo del carbonio, è opportuno completare la discussione considerando almeno una delle più importanti reazioni metaboliche in cui è coinvolto l'azoto, cioè il processo in cui l'azoto molecolare, N₂, viene convertito ad ammoniaca ed utilizzato come fonte di azoto per le biosintesi. Questo importante processo, chiamato fissazione dell'azoto, contribuisce al riciclo dell'azoto in natura ed è fondamentale non solo in agricoltura, ma anche per l'equilibrio globale della biosfera.

Fotosintesi

Uno dei più importanti processi biologici che si verificano sulla Terra è rappresentato dalla fotosintesi, la inversione dell'energia luminosa in energia chimica. Molti organismi fototrofi sono autotrofi, sono cioè in grado di crescere in presenza di CO₂ come unica fonte carbonio. L’energia proveniente dalla luce viene, quindi utilizzata per ridurre la CO₂ a composti organici. La capacità di effettuare la fotosintesi dipende dalla presenza di speciali pigmenti sensibili alla luce, le clorofille, presenti nelle piante, nelle alghe e in alcuni batteri. La luce arriva agli organismi fototrofi sotto forma di unità denominate quanti. L`assorbimento di quanti di luce da parte delle clorofille dà inizio al processo di conversione fotosintetica dell'energia.

La crescita di un organismo fotoautotrofo è caratterizzata da due distinti gruppi di reazioni: le reazioni alla luce, in cui l'energia luminosa viene convertita in energia chimica e le reazioni al buio, in cui l'energia chimica viene usata per ridurre la CO₂ a composti organici. Negli autotrofi, l'energia viene fornita come ATP .Mentre gli elettroni per la riduzione della CO₂ provengono dal NADPH, prodotto dalla riduzione del NADP⁺ utilizzando gli elettroni che derivano dai diversi donatori di cui discuteremo successivamente. Le reazioni alla luce determinano la conversione dell'energia luminosa in energia chimica sotto forma di ATP. ·I batteri rossi e verdi sfruttano l'energia luminosa per formare ATP e producono NADPH grazie a composti ridotti, presenti nell'ambiente, quali H₂S o composti organici (fotosintesi anossigenica).

·Al contrario, le piante verdi, le alghe ed i cianobatteri generalmente non utilizzano H₂S o composti organici per ottenere potere riducente, ma ricavano gli elettroni per riduzione del NADP⁺ dalla fotolisi di molecole di H₂O con produzione di O₂. La riduzione del NADP⁺ a NADPH in questi organismi è quindi un processo che dipende dalla luce. La fotosintesi che avviene in questi organismi viene definita fototosintesi ossigenica, poiché si ha produzione di ossigeno molecolare, O₂. Al contrario, nei batteri rossi e verdi in cui non si ha produzione di ossigeno il processo viene definito fotosintesi anossigenica.

Ruolo della clorofilla e della batterioclorofilla nella fotosintesi

La fotosintesi avviene solo negli organismi che possiedono alcuni tipi di clorofilla. La clorofilla, come i citocromi, è una porfirina, ma contiene un atomo di magnesio al centro dell'anello porfirinico, a differenza dei citocromi che presentano un atomo di ferro. La clorofilla contiene, inoltre, particolari sostituenti legati all'anello porfirinico, come pure una lunga molecola alcolica idrofobica.

Grazie alla presenza di questa catena (coda laterale), la clorofilla si associa ai lipidi e alle proteine idrofobiche delle membrane fotosintetiche.

La principale clorofilla delle piante superiori, di molte alghe e dei cianobatteri è la clorofilla a. La clorofilla a è di colore verde, in quanto assorbe preferenzialmente luce rossa e blu e trasmette luce verde. Le proprietà spettrali di ciascun pigmento possono essere più accuratamente espresse dal suo spettro di assorbimento, che indica la capacità del pigmento di assorbire luce a diverse lunghezze d'onda. Lo spettro di assorbimento di cellule contenenti la clorofilla a mostra un forte assorbimento della luce rossa (massimo di assorbimento ad una lunghezza d'onda di 68O nm) e blu (massimo di assorbimento ad una lunghezza d'onda di 43O nm).

Molte clorofille chimicamente differenti sono distinguibili in base al loro spettro di assorbimento. La clorofilla b, ad esempio, ha il massimo di assorbimento a 66O nm anzichè a 68O nm. Molte piante posseggono diverse clorofille, ma le più comuni sono la a e la b. Tra i procarioti, i cianobatteri posseggono la clorofilla a, mentre i batteri rossi e verdi hanno pigmenti con una struttura lievemente diversa, denominati batterioclorofille. La batterioclorofilla a dei batteri rossi ha un massimo di assorbimento intorno a 8OO e 85O-88O nm ; altre batterioclorofille assorbono a 72O-79O nm e un tipo di clorofilla assorbe a 1O2O nm.

Perché gli organismi possiedono diversi tipi di clorofilla in grado di assorbire la luce a differenti lunghezze d'onda? Una ragione sembra essere legata alla possibilitá di utilizzare in questo modo una maggiore quantità di energia dello spettro elettromagnetico. Poiché soltanto la luce assorbita può essere utilizzata biologicamente, gli organismi, essendo dotati di diverse clorofille, possono utilizzare la maggior parte dell'energia luminosa. Grazie al fatto di possedere pigmenti diversi, due organismi non strettamente correlati. possono coesistere in uno stesso habitat sfruttando ciascuno luce a diversa lunghezza d'onda. Quindi, la diversità di pigmenti ha anche un significato ecologico.

Membrane fotosintetiche

Qual’è la localizzazione dei pigmenti fotosintetici all'interno della cellula? Questi pigmenti, come tutti gli altri componenti dell'apparato fotosintetico, sono associati a speciali sistemi di membrane, denominati membrane fotosintetiche. La localizzazione di queste membrane fotosintetiche all'interno della cellula è diversa nei microrganismi eucariotici e procariotici.

Negli eucarioti l'apparato fotosintetico è presente in speciali organelli intracellulari denominati cloroplasti.

La clorofilla è associata a strutture costituite da membrane strettamente addossate una all'altra (lamellari) del cloroplasto. Questi sistemi di membrane fotosintetiche vengono definiti tilacoidi; le pile di tilacoidi sono denominate grana . I tilacoidi sono disposti in modo tale da dividere il cloroplasto in due regioni: la matrice che circonda i tilacoidi e lo spazio interno ai tilacoidi, il lume. Questa disposizione rende possibile la produzione di un gradiente di pH indotto dalla luce e di una forza motrice dei protoni che, come descriveremo nel prossimo paragrafo, può essere usata per sintetizzare ATP.

All'interno delle membrane del tilacoide, la clorofilla è associata in complessi di circa 2OO-3OO molecole. Soltanto poche di queste molecole di clorofilla partecipano direttamente alla conversione dell'energia luminosa in ATP. Queste speciali molecole sono denominate clorofille del centro di reazione e ricevono l'energia dalle numerose molecole di clorofilla che catturano la luce (antenna). Le molecole di clorofilla sono legate a proteine che controllano in modo preciso il loro orientamento nella membrana in modo tale che l'energia assorbita da una molecola di clorofilla possa essere efficientemente trasferita ad un'altra molecola.

Nei procarioti non sono presenti i cloroplasti e i pigmenti fotosintetici sono localizzati in un sistema di membrane interne che si origina dall'invaginazione della membrana citoplasmatica; un singolo centro di reazione contiene 25-3O molecole di batterioclorofilla in grado di catturare la luce.

I pigmenti antenna rendono il processo di fotosintesi più efficiente. Alle basse intensità di luce spesso predominanti in alcuni ambienti naturali, i centri di reazione possono essere eccitati solo una volta per secondo, il che non è sufficiente a garantire un efficiente processo fotosintetico. I pigmenti antenna addizionali permettono di catturare energia luminosa più rapidamente. Poiché la clorofilla del centro di reazione assorbe l'energia della luce soltanto in un intervallo molto limitato dello spettro, i pigmenti antenna addizionali hanno anche la funzione di ampliare l'intervallo dello spettro di luce disponibile.

Fotosintesi anossigenica

Il processo di sintesi dell'ATP mediato dalla luce coinvolge, in tutti gli organismi fototrofi, il trasporto di elettroni attraverso diversi trasportatori. Questi trasportatori di elettroni sono organizzati, nelle membrane fotosintetiche, in serie, da quello con potenziale negativo a quello con potenziale più positivo. Concettualmente, il flusso di elettroni nel processo fotosintetico è simile a quello della catena respiratoria. Nei batteri fototrofi in grado di crescere in aerobiosi (al buio), molti dei componenti coinvolti nel trasporto degli elettroni sono presenti nelle membrane di cellule cresciute sia alla luce (in condizioni anaerobiche) che al buio (in condizioni aerobiche). Ora prenderemo in considerazione la struttura dell'apparato fotosintetico nei fototrofi anossigenici e il trasporto fotosintetico di elettroni nei batteri rossi, dove il processo fotosintetico è stato ben descritto dal punto di vista molecolare.

Struttura dell'apparato fotosintetico nei batteri

L`apparato fotosintetico dei batteri rossi è contenuto in sistemi di membrane intracitoplasmatiche di morfologia variabile. Comunemente, queste membrane si presentano sotto forma di vescicole (cromatofori). L`apparato fotosintetico risulta costituito da quattro complessi di pigmenti e proteine legati alla membrana e da un complesso ATPasico che permette la sintesi dell'ATP a spese di un gradiente protonico. Tre di questi quattro complessi sono il centro di reazione, il componente I e il componente Il della cattura della luce. Il quarto complesso dell'apparato fotosintetico, il citocromo bc1 è comune sia alla catena respiratoria che a quella fotosintetica. Nei batteri rossi, i complessi coinvolti nella cattura della luce (o complessi antenna, come vengono spesso definiti), contengono due forme distinte di batterioclorofilla a chiamate rispettivamente B87O (componente I) e B8OO-85O (componente II). Il numero indica la lunghezza d'onda delle radiazioni assorbite più fortemente da questi tipi di batterioclorofilla. Come abbiamo precedentemente descritto per i fototrofi ossigenici, la funzione dei complessi antenna è quella di assorbire le radiazioni e incanalare l'energia al centro di reazione.

Il centro di reazione fotosintetico dei batteri rossi è stato cristallizzato e la sua struttura è stata determinata a livello atomico mediante diffrazione a raggi X. I centri di reazione di questi batteri contengono tre polipeptidi denominati subunità L, M, e H. Queste proteine sono strettamente associate alle membrane fotosintetiche . I polipeptidi L, M e H si legano al complesso fotochimico del centro di reazione che consiste di due molecole di batterioclorofilla a, due molecole addizionali di batterioclorofilla a la cui funzione non è nota, due molecole di batteriofeofitina (batterioclorofilla a priva dell'atomo di magnesio), due molecole di chinone e due molecole di pigmenti carotenoidi (pigmenti fotosintetici accessori). Tutti i componenti del centro di reazione sono integrati in modo tale da poter interagire velocemente nelle reazioni di trasferimento degli elettroni che, come vedremo, determinano la produzione di ATP

Flusso fotosintetico di elettroni

È necessario ricordare che il centro di reazione è circondato da pigmenti antenna, molecole di batterioclorofilla a, che dopo aver catturato la luce la convogliano su di esso. L`energia luminosa viene trasferita dai pigmenti antenna al centro di reazione in pacchetti detti eccitoni, uno stato elettronico a singoletto che migra dai pigmenti antenna al centro di reazione con alta efficienza. Il processo fotosintetico ha inizio quando l'energia degli eccitoni colpisce le molecole di batterioclorofilla a. L’assorbimento di energia eccita queste molecole di batterioclorofilla a convertendole in forti riducenti, in grado di ridurre una molecola accettrice con un potenziale molto basso. L`eccitazione della clorofílla rappresenta quindi l'effetto dell'energia luminosa sul sistema.

Prima dell'eccitazíone, il centro di reazione batterico ha un E^O` di circa +O,5 volt che diventa poi di circa -O,7 volt. Gli elettroni eccitati riducono una molecola di batteriofeofitina del centro di reazione. Questa transizione avviene velocemente (3 x 1O^-12 secondi). Una volta ridotta, la batteriofeofitina a riduce una molecola di chinone che, pur facendo parte del centro di reazione, è più vicina alla superficie esterna della membrana fotosintetica. Anche questa transizione è estremamente veloce e richiede meno di 1 x lO^-9 secondi. Il chinone è l'accettore primario di elettroni. Rispetto a quanto avviene nel centro di reazione, le reazioni successive di trasporto degli elettroni sono piuttosto lente, in quanto richiedono per verificarsi dai micro ai millisecondi. Dal chinone, gli elettroni vengono trasportati nelle membrane attraverso una serie di proteine ferro-zolfo e citocromi e ritornano alla fine al centro di reazione. Le proteine chiave per il trasporto degli elettroni includono il citocromo bc₁, e il citocromo c₂. Il citocromo c₂ è localizzato nello spazio periplasmico e funziona da collegamento tra il citocromo bc₁ legato alla membrana e il centro di reazione .

Inserire le due figure pag.425

Fotofosforilazione

La sintesi di ATP durante il flusso fotosintetico di elettroni è il risultato della formazione di un gradiente protonico generato dall'estrusione di protoni che si verifica durante il trasporto di elettroni e dall'attività dell'ATPasi accoppiata alla dissipazione del gradiente protonico. La serie di reazioni si completa quando il citocromo C₂ trasferisce gli elettroni alle batterioclorofille riportando queste molecole al loro potenziale originale (E^O '+ O,5 volt). Il centro di reazione è quindi in grado di assorbire nuova energia e ripetere il processo.

Questo sistema di produzione di ATP viene denominato fotofosforilazione ciclica, poiché gli elettroni vengono trasportati ripetutamente all'interno di un sistema chiuso; nella fotofosforilazione ciclica non c'è immissione o consumo di elettroni come avviene nella respirazione.

E` estremamente importante il fatto che le reazioni di ossidoriduzione appena descritte, mediate dalla luce, avvengano a livello delle membrane fotosintetiche. Si noti che, come nella catena respiratoria di trasporto degli elettroni, il complesso del citocromo bc₁, interagisce con il chinone per permettere il funzionamento del ciclo Q , che è il mezzo principale di generazione del gradiente protonico attraverso la membrana, utilizzato per produrre ATP .

NB:Quindi la funzione principale della luce, nella fotosintesi dei batteri rossi, è quella di generare un forte riducente che possa trasferire gli elettroni ai chinoni attraverso il centro di reazione; le rimanenti reazioni che portano alla sintesi di ATP sono simili a quelle che avvengono in un processo di respirazione.

Genetica della fotosintesi batterica

I batteri rossi fotosintetici sono procarioti Gram-negativi e alcune specie sono facilmente manipolabili a livello genetico. Alcune specie del genere Rhodobacter, in particolare R. capsulatus e R. sphaeroides, sono state quelle più utilizzate per lo studio genetico della fotosintesi nei batteri. In R. capsulatus, tutti i geni coinvolti nella fotosintesi sono organizzati in diversi operoni localizzati in una regione del cromosoma di circa 45-5O kb, denominato gruppo dei geni fotosintetici. I geni localizzati all'interno di questa regione codificano proteine coinvolte nella biosintesi della batterioclorofilla (geni bch), dei carotenoidi (geni crt) e di polipeptidi che legano le molecole di pigmento nel centro di reazione e nel complesso di cattura della luce (geni puf e puh).

Come si può immaginare, nei batteri fototrofi una sintesi efficiente di batterioclorofilla, carotenoidi e proteine specifiche per il legame dei pigmenti deve essere un processo altamente coordinato. Quando avviene la sintesi di nuovi complessi fotosintetici è necessario che nella cellula siano presenti, in corretta proporzione, i componenti per l'assemblaggio finale. Analisi biochimiche e genetiche condotte in R. capsulatus hanno evidenziato che l'espressione coordinata di questi componenti dell'apparato fotosintetico avviene grazie all'organizzazione degli operoni in superoperoni. I trascritti dell'operone responsabile della biosintesi dei pigmenti (bch e crt), invece di terminare all'estremità dell'operone , si estendono attraverso i promotori e i geni strutturali codificanti i polipeptidi del complesso fotosintetico, con la formazione di un trascritto di grosse dimensioni codificante diverse proteine. Questi superoperoni permettono, quindi, la trascrizione di molti geni funzionalmente correlati, i cui prodotti interagiscono formando il complesso fotosintetico che, poi, si integra nella membrana. Il principale responsabile della regolazione della trascrizione dei geni fotosintetici è l'O₂. L`ossigeno molecolare reprime la sintesi dei pigmenti fotosintetici in modo tale che, nei fototrofi anossigenici, la fotosintesi avvenga solo in condizioni di anaerobiosi. L`ossigeno interagisce, presumibilmente, con una proteina di regolazione che impedisce la trascrizione dei geni fotosintetici in condizioni aerobiche.

La fotosintesi anossigenica presenta una serie di importanti caratteristiche, simili a quelle del processo ossigenico che si verifica nelle piante verdi; l'analisi genetica nei batteri rossi ha, quindi, permesso la comprensione di fenomeni fotosintetici di base, in particolare dei processi di produzione dell'ATP mediati dalla luce. La notevole versatilità nutrizionale dei batteri rossi ha reso possibile l'isolamento di mutanti incapaci di effettuare la fotosintesi (questi mutanti possono crescere al buio mediante fermentazione o respirazione). Mutanti di R. capsulatus e R. sphaeroides incapaci di effettuare la fotosintesi sono stati usati per identificare e manipolare i geni chiave coinvolti nel processo fotosintetico.

Autotrofia e fotosintesi anossigenica

Come abbiamo già osservato, sia i batteri rossi che quelli verdi non producono O₂ durante la fotosintesi. Questo tipo di fotosintesi è quindi definito anossigenico. Le reazioni sopra descritte determinano la conversione dell'energia luminosa in legami fosforici ad alta energia dell'ATP. Tuttavia, se un organismo fototrofo anossigenico viene fatto crescere in presenza di CO₂ come unica fonte di carbonio, la produzione di ATP non è sufficiente. È necessario produrre anche potere riducente (NADPH) in modo che la CO₂ possa essere ridotta a livello del materiale cellulare. Nella fotosintesi anossigenica, a differenza di quella ossigenica dove la fonte di potere riducente è rappresentata da H₂O, gli elettroni provengono da composti ridotti presenti nell'ambiente.

Esempi di donatori di elettroni usati nella fotosintesi anossigenica sono:

· i composti ridotti dello zolfo (per esempio H₂S, zolfo elementare, tiosolfati),

· H₂ o composti organici (per esempio succinato, malato, butirrato).

· Una ristretta classe di batteri fototrofi può usare anche lo ione ferroso (Fe ²⁺) come donatore di elettroni, con formazione di Fe³⁺ come prodotto ossidato.

In condizioni di crescita autotrofa, i fototrofi anossigenici ossidano i donatori di elettroni riducendo il NADP⁺ a NADPH. Per esempio, durante la crescita in presenza di H₂S si ha la produzione di zolfo elementare: 6CO₂ + 12H₂S ® C₆H₁₂O₆ + 6H₂O + 12S^O. Lo zolfo così formato può essere accumulato sia all'esterno della cellula, come avviene nei batteri fototrofi verdi, sia all'interno, come avviene in alcuni batteri rossi.

Come avviene il trasferimento degli elettroni dai substrati ridotti al NADP⁺? Sono noti almeno due possibili meccanismi di produzione di NADPH a partire da composti ridotti:

1.Il primo prevede il trasferimento diretto da un composto notevolmente ridotto al NADP⁺. L`esempio migliore di donatore di elettroni capace di trasferire elettroni direttamente al NADP⁺ è l'H₂. Il potenziale di riduzione di H₂ è sufficientemente basso (-O,42 volt) da ridurre direttamente il NADP⁺ (-O,32 volt) purchè l'organismo possegga l'enzima idrogenasi che catalizza l'ossidazione di H₂. Tuttavia, molti fototrofi anossigenici possono crescere autotroficamente usando come donatori di elettroni solfuro o tiosolfato, i cui potenziali di riduzione sono più positivi di quelli della coppia NADP⁺/NADPH. In queste condizioni, gli elettroni entrano generalmente nella catena di trasporto degli elettroni a livello dei citocromi e vengono spinti nella direzione sfavorevole (contro gradiente) dal potenziale di membrana, con riduzione del NADP⁺ a NADPH. Questo processo, che richiede energia, viene definito trasporto inverso di elettroni; questo consumo di energia è giustificato dalla necessità di un riducente a basso potenziale per la fissazione della CO₂, e dal fatto di avere donatori di elettroni con un più alto potenziale di riduzione. Poiché gli elettroni si muovono in direzione termodinamicamente non favorevole, durante il trasporto inverso è richiesta energia, in questo caso il potenziale di membrana, per formare NADPH a partire da NADP⁺. Il trasporto inverso di elettroni è una caratteristica fondamentale anche della produzione di potere riducente nei procarioti chemiolitotrofi.

Molti batteri verdi e rossi sono anaerobi stretti, ma sono state identificate alcune specie in grado di crescere al buio, in condizioni aerobiche, come chemiorganotrofi. Dal punto di vista nutrizionale, i batteri rossi sono estremamente diversi e sono in grado di sfruttare una grande varietà di composti organici come fonte di carbonio, pur restando in grado di crescere autotroficamente quando necessario. Il termine fotoeterotrofo viene frequentemente utilizzato per descrivere un organismo fototrofo che utilizza composti organici come fonte di carbonio. Analogamente, il termine fotoautotrofo viene usato per descrivere un organismo che sfrutta l'energia luminosa e utilizza la CO₂ come unica fonte di carbonio.

Fotosintesi ossigenica

Il flusso di elettroni che si verifica nella fotosintesi ossigenica prevede due reazioni fitochimiche distinte, anche se interconnesse. Gli organismi che effettuano una fotosintesi ossigenica utilizzano la luce per produrre sia ATP sia NADPH; gli elettroni necessari per la sintesi di NADPH derivano dalla fotolisi di H₂O in ossigeno ed elettroni. I due sistemi di reazioni alla luce vengono chiamati fotosistema I e II e ciascun fotosistema possiede una clorofilla a del centro di reazione con caratteristiche spettrali diverse. La clorofilla del fotosistema I, chiamata P7OO, assorbe la luce a lunghezza d'onda lunga (rosso lontano) mentre quella del fotosistema II, P68O, assorbe meglio a lunghezza d'onda corta (rosso vicino). Come nella fotosintesi anossigenica, le reazioni fitochimiche avvengono all'interno di membrane. Negli eucarioti queste membrane sono localizzate nei cloroplasti, mentre nei cianobatteri sono organizzate in strutture all'interno del citoplasma. In entrambi i gruppi di fototrofi, le due forme di clorofilla a sono legate a proteine specifiche nella membrana con le quali interagiscono.

Il flusso di elettroni nella fotosintesi ossigenica assume un andamento approssimativamente simile alla lettera Z ruotata su di un lato. comunemente chiamato schema Z. E` necessario innanzitutto notare che la clorofilla a P68O del fotosistema II possiede un potenziale di riduzione molto alto, lievemente superiore a quello della coppia O<sub>2</sub>/H<sub>2</sub>O . Nella fotosintesi ossigenica, in seguito alla scissione dell'acqua in equivalenti ossidanti e riducenti , una reazione termodinamicamente sfavorevole, viene donato un elettrone alla molecola P68O dopo l'assorbimento di un quanto di luce a lunghezza d'onda pari a 68O nm. L`energia luminosa converte P68O in un riducente moderatamente forte, in grado di ridurre una molecola intermedia con E^O` di circa -O,2 volt. Le caratteristiche di questa molecola non sono ancora note. ma si pensa che possa trattarsi di una molecola di feofitina a (clorofilla a priva dell'atomo di magnesio). Da questa molecola gli elettroni vengono ceduti a diversi trasportatori di membrana, i chinoni, i citocromi e una proteina contenente rame, chiamata plastocianina, che dona elettroni al fotosistema I. L’elettrone viene trasferito alla clorofilla del centro di reazione del fotosistema I, P7OO, che ha precedentemente assorbito un quanto di luce e donato elettroni all'accettore primario del fotosistema I con un potenziale molto negativo E<sup>O</sup>` di circa -O,71 volt). Come nel fotosistema II, il primo accettore degli elettroni provenienti dal fotosistema I non è stato identificato, ma si pensa possa trattarsi di una forma di radicale libero della clorofilla a. In ogni caso l'accettore del fotosistema I, una volta ridotto, ha un potenziale di riduzione sufficientemente negativo da ridurre una proteina ferro-zolfo, la ferredossina, che successivamente riduce il NADP+ a NADPH .

Sintesi di ATP nella fotosintesi ossigenica

Accanto alla sintesi di potere riducente (NADPH), durante il flusso di elettroni da un fotosistema all'altro, avvengono altri importanti eventi. Il trasferimento di un elettrone dall'accettore del fotosistema II alla clorofilla del centro di reazione del fotosistema I avviene in direzione termodinamicamente favorevole (da negativo a positivo). Questo genera un potenziale di membrana (un gradiente protonico) che può essere sfruttato per la sintesi di ATP. La generazione di ATP mediante questo meccanismo, viene denominata fotofosforilazione non ciclica poiché gli elettroni vengono trasferiti direttamente dall'acqua al NADP+. In presenza di sufficiente potere riducente, anche i fototrofi ossigenici possono produrre ATP attraverso la fotofosforilazione ciclica processo in cui è coinvolto il solo fotosistema I. Questo si verifica quando l'accettore primario del fotosistema I, anziché ridurre la ferredossina (e quindi il NADP+), restituisce l'elettrone alla molecola P7OO attraverso i citocromi b ed f legati alla membrana. Questo flusso di elettroni crea un potenziale di membrana che permette una sintesi ulteriore di ATP.

Fotosintesi anossigenica nei fototrofi ossigenici

Normalmente i fotosistemi I e II funzionano insieme nel processo di fotosintesi ossigenica. Tuttavia, in particolari condizioni, molte alghe e cianobatteri sono in grado di effettuare la fotofosforilazione ciclica utilizzando il solo fotosistema I e ricavando il potere riducente da fonti diverse dall'acqua, con un processo anossigenico simile a quello dei batteri rossi e verdi. Questo evento si verifica in condizioni anaerobiche e in presenza di sostanze ridotte quali H₂ o H₂S. In queste condizioni, gli elettroni per la riduzione della CO₂ provengono non dall'acqua, ma da altri composti ridotti. Nelle alghe, l’H₂ è generalmente il donatore di elettroni e, dopo un periodo di adattamento alle condizioni anaerobiche, si osserva la produzione dell'enzima idrogenasi usato per assimilare l'H₂, che riduce direttamente il NADP⁺ a NADPH.

Alcuni cianobatteri possono usare H₂S come donatore di elettroni nella fotosintesi anossigenica. Quando viene usato H₂S, il composto viene ossidato a zolfo elementare (S) con accumulo di granuli di zolfo all'esterno della cellula, come avviene nei solfobatteri verdi. Il cianobatterio filamentoso Oscillatoria limnetica, trovato negli stagni salmastri ricchi di solfuri, è in grado di effettuare una fotosintesi anossigenica insieme a batteri fotosintetici rossi e verdi, con produzione di zolfo quale prodotto di ossidazione dei solfuri. In colture di O.limnetica, il flusso di elettroni del fotosistema II è fortemente inibito dalla presenza di H₂S rendendo, quindi, necessaria la fotosintesi anossigenica per la sopravvivenza in ambienti ricchi di questo composto.

Dal punto di vista evolutivo, l'esistenza della fotofosforilazione ciclica indica una stretta relazione tra la fotosintesi batterica e quella operata dalle piante verdi. Sebbene organismi come Oscillatoria limnetica, in grado di effettuare la fotosintesi ossigenica, abbiano acquisito il fotosistema II e quindi la capacità di utilizzare H₂O come donatore di elettroni, in particolari condizioni questi microrganismi possono utilizzare il solo fotosistema I.

Ulteriori aspetti delle reazioni fotosintetiche alla luce

Sebbene la presenza di clorofilla o batterioclorofilla sia indispensabile per la fotosintesi, gli organismi fototrofi posseggono altri pigmenti coinvolti nella cattura dell'energia luminosa, i carotenoidi e le ficobiline. Questi composti funzionano come pigmenti accessori e svolgono, principalmente un ruolo fotoprotettivo (carotenoidi) o servono come ulteriori pigmenti di cattura della luce (ficobiline).

Considereremo ora ciascuno di questi gruppi di pigmenti.

Carotenoidi

1 carotenoidi, identificabili in quasi tutti gli organismi fototrofi, sono i più diffusi pigmenti accessori. I carotenoidi, sono insolubili in acqua e si trovano fortemente ancorati alla membrana. Essi hanno una lunga catena idrocarburica. con legami singoli (C-C) e doppi (C=C) alternati, in una struttura che viene definita sistema di doppi legami coniugati.

Generalmente i carotenoldi sono gialli, rossi, marroni o verdi e assorbono luce nella regione blu dello spettro. I carotenoidi sono strettamente associati alla clorofilla nelle membrane fotosintetiche, ma non partecipano direttamente alle reazioni di fotofosforilazione. Essi possono tuttavia, trasferire al centro di reazione energia che può essere utilizzata nella fotofosforilazione, analogamente all'energia catturata direttamente dalla clorofilla.

Un`altra funzione dei carotenoidi è quella di agenti fotoprotettivi. La luce molto intensa può spesso essere dannosa per le cellule, in quanto può causare diverse reazioni di fotossidazione che possono portare alla distruzione della clorofilla e dell'apparato fotosintetico stesso. I carotenoidi assorbono gran parte di questa luce dannosa proteggendo la clorofilla; quindi, negli organismi fototrofi che devono vivere in presenza di luce, il ruolo fotoprotettivo dei carotenoidi è molto importante.

Ficobiline e ficobilisomi

I cianobatteri e le alghe rosse contengono le ficobiliproteine che, in questi organismi, sono i principali pigmenti responsabili della cattura della luce. Le ficobiliproteine possono essere di colore rosso o blu. Il pigmento rosso, chiamato ficoeritrina, assorbe luce a lunghezza d'onda di circa 55O nm, mentre il pigmento blu, quella a 62O nm. Un terzo pigmento, chiamato alloficocianina. assorbe a circa 65O nm. Le ficobiliproteine contengono tetrapirroli a catena aperta chiamate ficobiline, coniugati a proteine. Le ficobiliproteine si presentano come grossi aggregati ad alto peso molecolare denominati ficobilisomi, associati alle membrane fotosintetiche. I ficobilisomi sono organizzati in modo tale che le molecole di alloficocianina, circondate da molecole di ficocianina e ficoeritrina, siano a contatto con le membrane fotosintetiche. La ficoeritrina assorbe luce a lunghezze d'onda più corte (alta energia) e la trasferisce alla alloficocianina e quindi alla clorofilla del centro di reazione, alla quale è strettamente legata. I ficobilisomi permettono, quindi, un efficiente trasporto di energia dal complesso di biliproteine alla clorofilla a, permettendo la crescita dei cianobatteri anche ad intensità di luce abbastanza basse. Infatti, il contenuto di ficobilisomi aumenta nei cianobatteri al diminuire dell'intensità della luce, così che le cellule ricche in ficobilisorni sono quelle che crescono alle intensità di luce più basse.

La presenza di pigmenti accessori come carotenoidi e ficobiline è ovviamente vantaggiosa per l'organismo, in quanto la luce solare è distribuita nell'intero spettro del visibile, ma la clorofilla assorbe solo in una parte di questo spettro. Grazie alla presenza di pigmenti accessori, l'organismo è in grado di catturare gran parte della luce disponibile.

Fototassi

Molti microrganismi fototrofi si muovono verso la luce, un processo chiamato fototassi. Il vantaggio della fototassi è quello di permettere all'organismo di orientarsi rispetto alla luce in modo da rendere la fotosintesi più efficiente; infatti, quando luce diffratta colpisce un vetrino da microscopio sul quale sono collocati batteri fototrofi mobili, i microrganismi si dispongono in corrispondenza delle lunghezze d'onda alle quali assorbono i loro pigmenti.

Abbiamo già discusso i dettagli della chemiotassi, il fenomeno che permette, nei batteri mobili, l'allontanamento o l'avvicinamento ad una sostanza chimica. Il meccanismo di fototassi è piuttosto differente. I batteri presentano un tipo particolare di risposta, chiamata movimento shock. Quando una cellula batterica si sposta da una zona luminosa verso una zona priva di luce, si ferma immediatamente (come per uno shock) e cambia direzione. Questo movimento è la sola risposta che la cellula batterica compie al cambiamento delle condizioni di luce, ma è sufficiente per riportarla alla luce. Come avviene? Si immagini un batterio fototrofo in movimento in una zona di luce. Muovendosi, il microrganismo può accidentalmente uscire dal campo luminoso. Questo evento segnala alla cellula di fermarsi, invertire il movimento dei flagelli (e quindi la sua direzione) e ritornare nella zona luminosa. L`accumulo dei batteri a differenti lunghezze d'onda, si verifica in quanto i pigmenti dei batteri assorbono luce ad una determinata lunghezza d'onda meglio di altre, così che i batteri riconoscono queste regioni dello spettro come le più luminose. Si pensa che cambiamenti transienti nei livelli di ATP o nello stato di energizzazione della membrana (una misura della forza motrice dei protoni) possano servire da segnale molecolare che influenza la rotazione dei flagelli, probabilmente in modo simile a quanto accade nella chemiotassi con il chemiorecettore. Al microscopio, è possibile individuare batteri fototrofi in colture di arricchimento, interrompendo velocemente la sorgente di 1uce con una mano o con un pezzo di carta e successivamente ridando luce alla sospensione cellulare. Gli organismi fototrofi mobili si fermano quando il campo è oscurato e procedono in direzione opposta.

Fissazione autotrofa della CO₂

Nella prima parte di questo capitolo abbiamo discusso le reazioni alla luce degli organismi fototrofi. Ora ci occuperemo delle reazioni al buio, attraverso le quali gli autotrofi, sia fototrofi che chemiolitotrofi, convertono la CO₂ in materiale organico.

Sebbene tutti gli organismi richiedano piccole quantità di CO₂ per le biosintesi cellulari, gli autotrofi possono ricavare tutto il carbonio di cui necessitano dalla CO₂. Il processo è denominato fissazione della CO₂ e tutte le reazioni coinvolte possono avvenire completamente al buio, utilizzando ATP e potere riducente (NADPH) generato sia durante le reazioni alla luce nella fotosintesi sia durante l'ossidazione di composti inorganici . La maggior parte degli autotrofi finora esaminati possiede una speciale via di riduzione della CO₂, denominata ciclo di Calvin. Consideriamo ora alcune delle reazioni chiave di questo ciclo.

Enzimi chiave del ciclo di Calvin

La prima tappa nella riduzione della CO₂ è la reazione catalizzata dall'enzima ribulosío difosfato carbossilasi (RubísCO) che catalizza una reazione tra la CO₂ e la rìbulosio difosfato con formazione dì due molecole di acido 3-fosfoglicerico (PGA), una delle quali contiene l'atomo di carbonio proveniente dalla CO_2. Il PGA costituisce il primo intermedio identificabile nel processo di riduzione della CO₂‑ L’atomo di carbonio del PGA è ancora allo stesso livello di ossìdazione della CO₂; i due passaggi successivi prevedono la riduzione del PGA al livello di ossidazione dei carboidrati. In questo passaggio sono richiesti sia ATP che NADPH: il primo è coinvolto nella reazione di fosforilazione che attiva il gruppo carbossile, il secondo nella sua riduzione. L’atomo di carbonio proveniente dalla CO₂ è ora al livello di riduzione dei carboidrati (CH₂O), ma solo uno degli atomi di carbonio della gliceraldeide fosfato è derivato dalla CO₂, gli altri due atomi provengono dal ribulosio difosfato. La maggior parte delle rimanenti reazioni del ciclo di Calvin prevede riarrangiamenti, con formazione di nuove molecole di ribulosio difosfato, mentre parte del carbonio viene utilizzato nelle nuove sintesi cellulari.

Stechiometria del ciclo di Calvin

Nella Figura è rappresentato l'intero schema del ciclo di Calvin. Le reazioni che portano alla sintesi del ribulosio difosfato prevedono una serie di riarrangiamenti di zuccheri. Mediante enzimi coinvolti nella via dei pentoso fosfati e la via glicolitica, la gliceraldeide-3‑fosfato viene convertita nel ribulosio‑5‑fosfato e successivamente nel ribulosio difosfato.

È bene considerare che le reazioni del ciclo di Calvin sono basate sull'incorporazione di sei molecole di CO₂. La RubisCO per incorporare sei molecole di CO₂ richiede come accettore sei molecole di ribulosio difosfato. Questa reazione genera dodici molecole di acido 3-fosfoglicerico (36 atomi di carbonio totali), che servono come scheletro carbonioso per formare sei nuove molecole di ribulosio difosfato (3O atomi di carbonio totali) e una molecola di esoso per le biosintesi cellulari. Una complessa serie di riarrangiamenti che coinvolge intermedi C‑3, C‑5, C‑6 e C‑7 porta alla produzione finale di sei molecole di ribuloso‑5‑fosfato da cui si generano sei molecole di ribulosio difosfato. La tappa finale nella rigenerazione del ribulosio difosfato è la fosforilazione del ribulosio‑5‑fosfato a spese dell'ATP per intervento della fosforibulochinasi , un altro enzima presente unicamente nel ciclo di Calvin.

Quindi, nel ciclo di Calvin, sei molecole di CO₂ e sei di ribulosio difosfato (C‑5) reagiscono a formare dodici molecole C‑3. Due delle molecole C‑3 portano alla biosintesi di uno zucchero a sei atomi di carbonio, mentre le rimanentì dìeci molecole vengono riciclate per formare sei molecole accettrici C‑5. È evidente la natura ciclica del ciclo di Calvin, in quanto la sequenza di reazioni inizia e termina con lo stesso numero di molecole accettrici.

Energia e potere riducente necessari nel ciclo di Calvin

Consideriamo ora l'intera stechiometria della conversione di sei molecole di CO₂ in una di fruttosio‑6‑fosfato. Nel ciclo sono richieste dodici molecole di ATP e dodici di NADPH per la riduzione di dodici molecole di PGA a gliceraldeide fosfato e sei molecole di ATP per la conversione del ribulosio fosfato a ribulosio difosfato. Quindi, per la produzione di una molecola di esoso a partire dalla CO₂ sono richieste dodici molecole di NADPH e diciotto di ATP. Le molecole di esoso prodotte possono essere convertite in polimeri di riserva, come il glicogeno, l'amido o il poli‑b‑idrossialcanoato , quando l’ATP e il NADPH sono in eccesso, ed essere poi usati come fonte di carbonio ed energia in altre condizioni, ad esempio in assenza di luce.

Vie alternative al ciclo di Calvin

Gli enzimi chiave del ciclo di Calvin, la ribulosio difosfato carbossilasi e fosforibulochinasi, sono presenti unicamente negli autotrofi che fissano la CO₂ attraverso questo ciclo. Questi enzimi sono stati trovati in tutti gli organismi fototrofi esaminati, piante, alghe e batteri ed anche in molti batteri chemiolitotrofi come i solfobatteri, i ferrobatteri e i batteri nitrificanti. L’enzima ribulosio difosfato carbossilasi è, talvolta, presente nella cellula in strutture intracellulari chiamate carbossisomi.

Tuttavia, diversi gruppi di autotrofi, come i batteri fototrofi verdi, i metanogeni e i batteri acetogeni non usano il ciclo di Calvin per la fissazione della CO₂. In questi gruppi non sono presenti gli enzimi del ciclo di Calvin e la fissazione della CO₂ avviene attraverso il ciclo riduttivo degli acidi tricarbossilici o la via dell'acetilCoA.

Chemiolitotrofi: energia dall'ossidazione di composti inorganici

Gli organismi che possono ricavare l'energia dall'ossidazione di composti inorganici vengono chiamati chemiolitotrofi. Molti batteri chemiolitotrofi sono anche autotrofi, in quanto sono in grado di utilizzare la CO₂ come fonte di carbonio. Come abbiamo già notato, quando un organismo cresce in presenza di CO₂ come unica fonte di carbonio, sono essenziali due componenti: energia in forma di ATP e potere riducente. Nei chemiolitotrofi la produzione di ATP avviene in modo simile ai chemiorganotrofi, con la differenza che il donatore di elettroni è un composto inorganico. La sintesi di ATP è quindi accoppiata all'ossidazione del donatore di elettroni. Nei chemiolitotrofi, il potere riducente può essere ottenuto sia direttamente da composti inorganici con un potenziale di riduzione sufficientemente basso, sia attraverso le reazioni di trasporto inverso degli elettroni, già discusse per i batteri fototrofi .

Energetica nei chemiolitotrofi

Ricordiamo che, tanto più due semireazioni sono lontane, tanto maggiore è l'energia che può essere liberata. Per esempio, la differenza del potenziale di riduzione della coppia H⁺/H₂ e di quella ½O₂/H₂O è ‑1,23 volt, equivalente ad una energia libera di ‑237 kJ/mole. Invece, la differenza di potenziale tra la coppia H⁺/H₂ e la coppia NO₃^‑/NO₂^‑ è più bassa, ‑O,84 volt, equivalente ad un'energia libera di ‑163 kJ/mole. Questa energia è ancora sufficiente per la produzione di ATP (i legami fosforici ad alta energia dell'ATP hanno un energia libera di circa ‑31,8 kJ/mole). Tuttavia, un calcolo del genere evidenzia come l'energia disponibile sia insufficiente quando si ossida H₂S utilizzando la CO₂ come accettore di elettroni.

Da valutazioni di questo tipo è possibile ipotizzare il genere di chemiolitotrofi che possono essere trovati in natura. Poiché gli organismi seguono le leggi della termodinamica, solo le reazioni che sono termodinamicamente favorevoli sono in grado potenzialmente di produrre energia. Tuttavia, il fatto che una reazione sia teoricamente possibile, non significa che si verifichi realmente.

Idrogenobatteri

Diversi chemiolitotrofi sono in grado di utilizzare come unica fonte di energia l'idrogeno (H₂), un prodotto comune del metabolismo microbico. Sono noti diversi idrogenobatteri che differiscono per l'accettore di elettroni utilizzato. Gli idrogenobatteri che usano un accettore di elettroni diverso dall'ossigeno effettuano un tipo di respirazione anaerobica che discuteremo più avanti. Ci occupiamo ora delle specie aerobiche di idrogenobatteri, che sono quelle a cui normalmente ci si riferisce quando si parla di idrogenobatteri.

Gli idrogenobatteri sono chemiolitotrofi facoltativi capaci di crescere sia come chemiorganotrofi in presenza di composti organici, sia come chemiolitotrofi attraverso l'ossidazione di H₂. Dal punto di vista tassonomico e filogenetico gli idrogenobatteri appartengono a gruppi di batteri diversi. Gli idrogenobatteri quando crescono in condizioni di autotrofia, ossidano H₂ con la seguente reazione:

6H₂ + 2O₂ + CO₂ ‑‑> (CH₂O) + 5H₂O

dove CH₂O indica il materiale cellulare allo stato ossidazione dei carboidrati.

Abbiamo visto i cambiamenti di energia libera che avvengono nelle reazioni sopra citate. L’enzima idrogenasi catalizza l'ossidazione di H₂ con trasferimento degli elettroni al NAD⁺ o al chinone. Gli elettroni introdotti nella catena di trasporto degli elettroni a livello del NADH o del chinone ridotto vanno incontro a reazioni di trasporto con la formazione, come già discusso, di una forza motrice dei protoni e di ATP prodotto mediante una ATPasi di membrana.

Molti batteri incapaci di autotrofia possono ossidare H₂ come unica fonte di energia. Per esempio, Escherichia coli può utilizzare H₂ come fonte di energia ma non può crescere in presenza di CO₂ come unica fonte di carbonio. In presenza di H₂, è necessario fornire a E. coli un composto organico come fonte di carbonio. Gli organismi che utilizzano un composto inorganico come fonte di energia ed uno organico come fonte di carbonio vengono talvolta definiti anche mixotrofi.

Molti batteri solfatoriduttori, i batteri omoacetogeni e la maggior parte dei metanogeni, come discuteremo in questo capitolo, possono usare H₂ come donatore di elettroni.

Quando gli idrogenobatteri si comportano da autotrofi, fissano la CO₂ attraverso il ciclo di Calvin. In presenza di composti organici, la sintesi degli enzimi del ciclo di Calvin viene repressa, mentre vengono indotti gli enzimi coinvolti nell'utilizzazione del composto organico. Negli idrogenobatteri, la regolazione del metabolismo chemiolitotrofo è molto fine e specifica; l'espressione genica viene regolata sia da elementi del metabolismo del carbonio sia da elementi del metabolismo energetico.

Solfobatteri

Molti composti ridotti dello zolfo possono essere utilizzati come donatori di elettroni da diversi solfobatteri incolori (vengono chiamati "incolori' per distinguerli dai solfobatteri verdi e rossi contenenti batterioclorofilla (pigmentati) discussi precedentemente in questo capitolo). I composti dello zolfo più comunemente utilizzati come fonte di energia sono l'acido solfidrico (H₂S), lo zolfo elementare (S) e il tiosolfato (S₂O₃^2‑). Il prodotto finale di ossidazione di questi composti è nella maggior parte dei casi il solfato (SO₄^2‑); durante l'ossidazione di H₂S (stato di ossidazione ^‑2) a solfato (stato di ossidazione ⁺⁶) vengono rimossi 8 elettroni. Quando viene utilizzato un composto dello zolfo con uno stato di ossidazione intermedio è disponibile meno energia:

H₂S + 2O₂ -> SO₄ ^2- + 2H⁺ acido solfidrico -798,2 kJ/reazione

S + H₂O + 11/2O₂ -> SO₄ ^2- + 2H⁺ zolfo elementare -587,1 kJ/reazione

S₂O₃ ^2- + H₂O + 2O₂ -> 2SO₄^2--+ 2H⁺ tiosolfato -822,6 kJ/reazione (411 kJ/per atomo di zolfo ossidato)

L’ossidazione del composto più ridotto dello zolfo, H₂S, avviene a tappe e la prima reazione porta alla produzione di zolfo elementare S. Alcuni batteri, che ossidano H₂S accumulano lo zolfo elementare all'interno della cellula. Lo zolfo accumulato in seguito all'ossidazione rappresenta una riserva dalla quale è possibile ottenere energia con la sua ossidazione a solfato, quando la disponibilità di H₂S diminuisce.

Quando viene fornito zolfo elementare come donatore di elettroni, il microrganismo deve crescere associato alle particelle di zolfo a causa dell'estrema insolubilità dello zolfo elementare. Aderendo alle particelle il microrganismo può disporre degli atomi di zolfo di cui necessita, che passano lentamente in soluzione. Non appena questi atomi vengono ossidati, molti si dissolvono e gradualmente lo zolfo viene utilizzato.

Si noti che nelle reazioni di ossidazione dello zolfo riportate, uno dei prodotti ottenuti è H⁺. La produzione di protoni determina un abbassamento del pH e una delle conseguenze dell'ossidazione dei composti ridotti dello zolfo è l'acidificazione del terreno di crescita. L’acido solforico, H₂SO₄, prodotto dai solfobatteri spesso causa riduzioni drastiche di pH. Alcuni solfobatteri sono in grado di abbassare il pH a valori inferiori a l!

Metabolismo energetico e del carbonio nei solfobatteri chemiolitotrofi

Il sistema di trasporto degli elettroni di un tipico solfobatterio è illustrato nella Figura.

Come si vede, gli elettroni provenienti dai composti ridotti dello zolfo entrano nella catena di trasporto a diversi livelli (in funzione del loro potenziale di riduzione) e vengono trasportati all'ossigeno molecolare; l'intero processo genera un potenziale di membrana che porta alla sintesi di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Gli elettroni per la riduzione della CO₂ derivano dalle reazioni di trasporto inverso degli elettroni con produzione di NADPH (Figura sopra). Si noti nella Figura come il potenziale di riduzione relativamente alto di composti come S₂O₃ ^2‑ o S^O determini l'ingresso degli elettroni ad un livello più basso della catena di trasporto degli elettroni con una resa energetica inferiore, mentre è richiesta una maggiore quantità di energia per la riduzione del NADPH. Queste limitazioni di carattere biochimico sono responsabili, in parte, della bassa resa di crescita di molti solfobatteri chemiolitotrofi.

I solfobatteri, quando crescono autotroficamente, usano il ciclo di Calvin per fissare la CO₂. Tuttavia, alcuni solfobatteri sono in grado di crescere anche utilizzando composti organici. Alcuni solfobatteri possono crescere anaerobicamente su composti ridotti dello zolfo utilizzando il nitrato (NO₃^2‑ ) come accettore di elettroni. In queste condizioni compiono una respirazione di tipo anaerobico. Molti solfobatteri sembrano avere un metabolismo mixotrofico in quanto utilizzano H₂S come fonte di energia ed un composto organico come fonte di carbonio. A questo gruppo appartiene Begiatoa, un organismo largamente diffuso nei sedimenti marini e d'acqua dolce.

Ferrobatteri

Alcuni batteri ricavano l'energia dall'ossidazione aerobica del ferro dallo stato ferroso (Fe²⁺) allo stato ferrico (Fe³⁺ ). Da questa ossidazione risulta disponibile solo una quantità limitata di energia; per questa ragione, i ferrobatteri devono ossidare grandi quantità di ferro per poter crescere. Lo ione ferrico forma un composto altamente insolubile, l'idrossido di ferro (Fe(OH)³) che precipita in acqua. Molti ferrobatteri ossidano anche lo zolfo e quindi si comportano da acidofili obbligati.

Questo avviene in quanto, a pH neutro, lo ione ferroso si ossida rapidamente e spontaneamente allo stato ferrico e diventa quindi stabile solo in condizioni di anaerobiosi. A pH acido, lo ione ferroso è stabile all'ossidazione chimica. Poiché l'ossidazione spontanea dello ione ferroso in presenza di ossigeno a pH neutro è molto rapida, in queste condizioni non si verifica un accumulo significativo di ioni ferrosi. Questo spiega perché molti ferrobatteri sono acidofili. obbligati.

Thiobacillusferrooxidans, il ferrobatterio più conosciuto, è in grado di crescere autotroficamente usando come donatori di elettroni sia lo ione ferroso sia composti ridotti dello zolfo. Il sistema di trasporto degli elettroni è illustrato nella Figura.

Questo organismo è molto comune negli ambienti contaminati da acidi, come i drenaggi acidi di miniera. Un altro procariote ferro‑ossidante è l'archebatterio Sulfolobus, che vive nelle sorgenti calde ed acide, a temperature vicine al punto di ebollizione dell'acqua.

Energia rìcavata dall'ossidazione di ioni ferrosi

La bioenergetica dell'ossidazione del ferro effettuata da T.ferrooxídans è di notevole interesse biochimico a causa dell'alto potenziale di riduzione della coppia Fe³⁺/Fe²⁺ (+ O,77 volt) . La catena respiratoria di T. ferrooxidans contiene citocromi di tipo c ed a₁ e una proteina contenente rame, chiamata rusticianina. Poiché il potenziale di riduzione della coppia Fe³⁺ /Fe²⁺ è così alto, la via di trasporto degli elettroni all'ossigeno (1/2 O₂/H₂O, E^O' = +O,82 volt) sarà ovviamente molto breve. Gli elettroni provenienti dall'ossidazione di Fe²⁺ non possono ridurre il NAD⁺, il FAD o molti degli altri componenti della catena di trasporto degli elettroni. In che modo allora gli acidofili ferro‑ossidanti producono ATP?

Studi biochimici condotti sulla catena di trasporto degli elettroni in Thiobacillus ferrooxidans suggeriscono che i ferrobatteri sfruttano un gradiente protonico preesistente nel loro ambiente per generare energia. Ricordiamo che il citoplasma di qualsiasi organismo, incluso quello degli acidofili, si deve mantenere vicino alla neutralità; in T.ferrooxidans il pH interno è circa 6. Tuttavia il pH dell'ambiente in cui vive T.ferroxidans è molto più basso, vicino a pH 2. Questa differenza di pH che si crea attraverso la membrana citoplasmatica rappresenta una forza motrice dei protoni naturale che può essere sfruttata per la sintesi di ATP. Comunque, per mantenere un ambiente neutro è necessario che i protoni, che entrano nella cellula attraverso la traslocazione protonica mediata dall'ATPasi (che dirige la fosforilazione dell'ADP), vengano consumati. A questo punto l'ossidazione di Fe²⁺ assume un ruolo importante.

L’ossidazione di Fe²⁺ a Fe³⁺ (2Fe²⁺ + 1/2O₂ + 2H⁺‑> 2Fe³⁺ + H₂O) è una reazione che consuma protoni. Evidenze sperimentali suggeriscono che la reazione 1/2 O₂ + 2H⁺‑‑> H₂O avvenga sulla faccia interna della membrana citoplasmatica, mentre la reazione Fe²⁺ ‑‑‑> Fe³⁺ in prossimità della faccia esterna. Gli elettroni derivanti da Fe²⁺ vengono ceduti nello spazio periplasmico alla rusticianina , una proteina stabile agli acidi e con un optimum di pH intorno a 2. Gli elettroni vengono donati dalla rusticianina ad un citocromo c, legato alla membrana, con un potenziale insolitamente alto che successivamente li trasferisce al citocromo a₁, l'ossidasi terminale . Il citocromo a₁ dona gli elettroni a 1/2O₂, mentre i due protoni richiesti per la formazione di una molecola d'acqua provengono dal citoplasma. Finchè rimane disponibile Fe²⁺, un afflusso di protoni garantito dall'ATPasi genera una forza motrice dei protoni naturale attraverso la membrana di T.ferrooxidans utilizzata per la sintesi di ATP Quindi, sebbene la produzione dell'energia in T.ferrooxidans sia il risultato di una reazione chemiosmotica catalizzata dall'ATPasi che accoppia l'entrata di protoni con la sintesi di ATP il gradiente protonico in questo batterio non si origina dal trasporto degli elettroni, ma è invece semplicemente la conseguenza dell'ambiente in cui il microrganismo vive!

Come abbiamo già discusso precedentemente, la fissazione autotrofa della CO₂ richiede la presenza sia di ATP sia di potere riducente. Il potere riducente in forma di NADH o di NADPH viene generato dal processo di trasporto inverso degli elettroni, già visto in questo capitolo, che utilizza l'energia dell'ATP per garantire un flusso inverso di elettroni con formazione di NADH o NADPH. A causa dell'alto potenziale del donatore di elettroni, in questo processo è necessario ossidare una notevole quantità di ferro ed è quindi comprensibile che le rese di crescita di questi batteri siano piuttosto basse. La presenza di questi batteri nell'ambiente in cui vivono non viene evidenziata dalla formazione di notevoli quantità di materiale cellulare, ma dalla presenza di massive quantità di precipitati di ioni ferrici .

Ossidazione del ferro a pH neutro

Oltre ai ferrobatteri appena discussi, sono noti altri gruppi di batteri tradizionalmente considerati ferrobatteri, ma in grado di crescere a pH neutro. Questi batteri vivono a pH neutro e si trovano comunemente in quegli ambienti dove gli ioni ferrosi migrano da condizioni anaerobiche a condizioni aerobiche. Come abbiamo già visto, a pH neutro lo ione ferroso non è stabile in presenza di ossigeno e viene rapidamente ossidato allo stato ferrico (insolubile). Per questo motivo, l'unico ambiente a pH neutro dove sono presenti ioni ferrosi è l'interfaccia tra una condizione anaerobica ed una aerobica. Gallinella ferruginea, Sphaerotilus natans e Leptothrix ochracea vivono, generalmente, insieme nei caratteristici depositi che essi formano. Soltanto in Gallionella è stata evidenziata una vera autotrofia. Colture dì G. ferruginea crescono in presenza di CO₂ come unica fonte di carbonio, fissandola con il ciclo di Calvin. L’autotrofia negli altri ferrobatteri in grado di crescere a pH neutro non è ancora stata provata.

Oltre agli ioni ferrosi, anche il manganese viene ossidato a pH neutro da un ristretto gruppo di batteri. Il più comune batterio che ossida il manganese è Leptotrix discophorus.

Batteri ammonio e nitrito‑ossidanti

I più comuni composti inorganici dell'azoto usati come donatori di elettroni sono l'ammoniaca (NH₃) e i nitriti (NO₂^-) che vengono ossidati in condizioni aerobiche dai batteri nitrificanti. I batteri nitrificanti sono largamente distribuiti nel suolo e nelle acque. Un gruppo di organismi (di cui Nitrosomonas è un genere) ossida l'ammoniaca a nitriti e un altro gruppo (Nitrobacter) ossida i nitriti a nitrati. L’attività combinata di questi due gruppi di microrganismi determina l'ossidazione completa dell'ammoniaca a nitrati, con trasferimento di otto elettroni.

Energia e autotrofia nei batteri nitrificanti

Gli elettroni provenienti dai composti dell'azoto entrano nella catena di trasporto degli elettroni e il flusso di elettroni crea un potenziale di membrana ed una forza motrice dei protoni che genera ATP. I batteri nitrificanti, a causa del potenziale di riduzione dei loro donatori di elettroni, presentano una resa energetica simile a quella dei solfobatteri chemiolitotrofi. L’Eº' della coppia NH₂OH/NH₃, la prima tappa nell'ossidazione di NH₃, è circa O volt. L’Eº' della coppia NO^3‑ /NO^2‑ è molto alto, circa +O,43 volt. Questi potenziali di riduzione relativamente alti indicano che nei batteri nitrificanti gli elettroni entrano nella catena di trasporto ad un livello basso (citocromo a o c), limitando, quindi, la quantità di ATP che può essere prodotta da ciascuna coppia di elettroni introdotta.

Nell'ossidazione dei composti ridotti dell'azoto sono coinvolti diversi enzimi chiave. Nei batteri ammonio ossidanti, NH₃ viene ossidato dall'enzima ammonio monoossigenasi con formazione di NH₂OH e H₂O. Successivamente l’idrossilammina ossidoreduttasi ossida NH₂OH a NO₂^‑, con rimozione di quattro elettroni. L’ammonio monoossigenasi è una proteina di membrana, mentre l'idrossilammina ossidoreduttasi è una proteina periplasmatica. Nella reazione catalizzata dall'ammonio monoossigenasi:

NH₃ + O₂ + 2H⁺ + 2e ^- àNH₂OH + H₂O

sono necessari due elettroni per ridurre un atomo di ossigeno ad acqua. Questi elettroni derivano dall'ossidazione dell'idrossilammina e vengono forniti all'ammonio monoossigenasi dall'idrossilammina ossidoreduttasi tramite il citocromo c. Quindi dall'ossidazione dell'NH₃ a NO₂^‑ vengono generati quattro elettroni, ma soltanto due arrivano all'ossidasi terminale (il citocromo aa3).

I batteri nitrito‑ossidanti utilizzano l'enzima nitrito ossidasi per ossidare i nitriti a nitrati, con un breve trasporto di elettroni (a causa dell'elevato potenziale della coppia NO₃^‑/NO₂^-) all'ossidasi terminale. Nella catena di trasporto degli elettroni dei batteri nitrito‑ossidanti sono presenti i citocromi di tipo a e c ed il potenziale di membrana (che dirige la sintesi di ATP) probabilmente si genera direttamente durante l'ossidazione di NO₂^‑. Come avviene nell'ossidazione del ferro, soltanto una piccola quantità di energia è disponibile. Quindi le rese di crescita dei batteri nitrificanti sono relativamente basse.

La resa di crescita dei batteri nitrificanti risente anche dell'energia richiesta per la fissazione della CO₂. Come nei chemiolitotrofi zolfo e ferro‑ossidanti, i batteri nitrificanti utilizzano il ciclo di Calvin per la fissazione della CO₂ e l'ATP richiesto per questo processo (18 molecole di ATP per ogni molecola dì glucosio prodotta) pesa ulteriormente su un sistema di generazione dell'energia già inefficiente. Le limitazioni energetiche sono particolarmente marcate nei batteri nitrito‑ossidanti ed è forse per questa ragione che la maggior parte di questi microrganismi si comporta da chemiorganotrofi in presenza di glucosio ed altri substrati organici.

Riassunto sull'autotrofia e sulla produzione di ATP nei chemiolitotrofi

Come abbiamo già visto, quando i chemiolitotrofi crescono autotroficamente devono produrre, oltre all'ATP potere riducente per poter utilizzare la CO₂ come unica fonte di carbonio. Sebbene il NAD⁺ possa essere ridotto direttamente a NADH da H₂, gli altri composti inorganici che fungono da donatori di elettroni hanno un potenziale di riduzione più alto rispetto a quello del NADH. Se il potenziale di riduzione di un donatore di elettroni è più alto di quello del NADH non è possibile che la sua ossídazione possa essere direttamente accoppiata alla riduzione di NAD⁺ a NADH. Quindi il NAD⁺ deve essere ridotto da un trasporto inverso di elettroni come già discusso nelle sezioni precedenti.

Produzione di ATP da parte dei chemiolitotrofi

Come abbiamo sottolineato nella discussione dei singoli gruppi di chemiolitotrofi, questi batteri contengono tutti catene di trasporto degli elettroni costituite da citocromi, chinoni e molti dei principali componenti descritti negli organismi chemiorganotrofi aerobi. Comunque, fatta eccezione per H₂, nessun composto inorganico ridotto ha un Eº' sufficientemente basso da ridurre direttamente il NAD⁺, quindi gli elettroni devono entrare nella catena di trasporto ad un livello in cui il potenziale di riduzione del donatore di elettroni è più negativo di quello della molecola accettrice. Nella maggior parte dei casi, l'accettore di elettroni risulta essere un citocromo o un enzima che cede gli elettroni ad un citocromo. Come abbiamo visto, i ferrobatteri e i batteri nitrito‑ossidanti sono particolarmente poco efficienti in quanto il potenziale di riduzione dei loro donatori di elettroni è già molto alto. Questo si ripercuote direttamente sulla resa di crescita.

La resa energetica dell'ossidazione dell'idrogeno e dello zolfo è più favorevole di quella dei batteri nitrito‑ o ferro‑ossidanti, poiché l'ATP prodotto è direttamente proporzionale alla quantità di energia lìberata da una determinata ossidazione e la quantità di energia prodotta dipende dalla differenza del potenziale di riduzione tra il donatore e l'accettore di elettroni. Inoltre, a causa dell'autotrofia, la maggior parte dei chemiolitotrofi sintetizza solo piccole quantità di materiale cellulare, pur ossidando notevoli quantità di substrato, a differenza dei chemiorganotrofi. Da un punto di vista ecologico, comunque, è bene ricordare che i chemiolitotrofi sfruttano, come donatori di elettroni, composti non utilizzabili dagli organismi chemiorganotrofi. Quindi, i chemiolitotroti sopravvivono in natura senza che si creino particolari competizioni nutrizionali con altri microrganismi.

Confronto tra metabolismo energetico e del carbonio

La capacità di alcuni chemiolitotrofi di assimilare composti organici come fonte di carbonio e di ricavare energia dalle ossidazioni di composti inorganici rende possibile la crescita di questi organismi come chemiolitotrofi eterotrofi. Si parla, in questo caso, di crescita mìxotrofica. Alcuni chemiolitotrofi crescono meglio in condizioni di mixotrofia, in quanto non devono fissare la CO₂, processo che richiede energia. È noto almeno un solfobatterio, Beggiatoa, che sembra richiedere condizioni mixotrofe per usare i composti ridotti dello zolfo come donatori di elettroni. Molti ceppi di Beggíatoa sono incapaci di crescere in presenza di composti ridotti dello zolfo e CO₂, ma possono utilizzare i composti dello zolfo come donatori di elettroni quando è presente l'acetato. Beggiatoa è in grado di crescere anche in presenza di acetato come unica fonte di carbonio ed energia, in assenza di composti ridotti dello zolfo. La mixotrofia permette ad un organismo di sfruttare sia i vantaggi offerti dalla chemiolitotrofia sia quelli offerti dalla chemiorganotrofia. Studi condotti su colture miste hanno mostrato che la maggior parte dei mixotrofi non è in grado di competere con i chemiolitotrofi o con i chemiorganotrofi stretti quando il microrganismo è costretto a crescere in una determinata condizione nutrizionale. Quindi, la maggior parte dei mixotrofi ha successo in natura solo quando sono presenti contemporaneamente composti sia inorganici che organici.

Respirazione anaerobica

Nella respirazione aerobica l'ossigeno molecolare (O₂) funge da accettore finale esterno di elettroni che vengono ceduti dal NADH e trasportati fino all'ossigeno, attraverso una catena di trasporto. Possono pero` essere usati anche diversi altri accettori di elettroni alternativi all'ossigeno e, in questi casi, si parla di respirazione anaerobica. In questa sezione verranno discussi alcuni dei processi di respirazione anaerobica oggi noti.

Nella maggior parte dei casi, le fonti di energia utilizzate nelle respirazioni anaerobíche sono composti organici: tuttavia, esistono diversi batteri che fanno una respirazione anaerobica utilizzando donatori di elettroni inorganici (chemiolitotrofi). La maggior parte degli accettori di elettroni di cui discuteremo sono composti inorganici, ma anche parecchi composti organici possono svolgere questo ruolo. Quasi tutti i microrganismi capaci di respirazione anaerobica sono procarioti e le trasformazioni chimiche da loro compiute durante i processi di generazione dell'energia sono spesso di grande importanza ecologica o industriale.

I batteri che compiono una respirazione anaerobica di solito possiedono sistemi di trasporto di elettroni che contengono citocromi, chinoni, proteine ferro‑zolfo, e altre tipiche proteine trasportatrici di elettroni. I loro sistemi respiratori, quindi, sono analoghi a quelli dei normali aerobi. In alcuni organismi, come nei batteri denitrificanti, il processo di respirazione anaerobica compete con il processo di respirazione aerobica. In questi casi, la presenza di O₂ di solito favorisce la respirazione aerobica, e soltanto quando la concentrazione di ossigeno nell'ambiente si è molto abbassata, vengono sfruttati accettori di elettroni alternativi. Altri microrganismi che utilizzano la respirazione anaerobica sono anaerobi obbligati, del tutto incapaci di utilizzare l'ossigeno.

L`energia liberata dall'ossidazione di un composto usando O₂ come accettore finale di elettroni è molto maggiore di quella liberata quando lo stesso composto viene ossidato utilizzando un accettore di elettroni alternativo. Come è stato discusso all'inizio di questo capitolo, le rese energetiche teoriche possono essere calcolate utilizzando le differenze di potenziale di ossidoriduzione tra il donatore e l'accettore di elettroni. Dato che la coppia O₂/H₂O è quella con il maggior potenziale di ossidoriduzione, quando viene utilizzato l'O₂ piuttosto che un altro accettore di elettroni si rende disponibile una maggiore quantità di energia. Altri accettori di elettroni con potenziali vicini a quelli dell'ossigeno sono Fe³⁺, NO₃^‑, e NO₂^-. Con potenziali inferiori troviamo Sº, CO₂, e SO₄ ^2‑ .

Metabolismo assimilativo e dissimilativo

Composti inorganici come NO₃^‑, SO₄^2‑ e CO₂, possono essere ridotti da diversi organismi per essere utilizzati rispettivamente come fonti di azoto, zolfo e carbonio. I prodotti finali di queste reazioni sono rispettivamente gruppi amminici (‑NH₂), gruppi sulfidrilici (‑SH) e composti organici del carbonio (allo stato di ossidazione dei carboidrati o più basso). La nutrizione dei microrganismi è stata discussa brevemente in “nutrizione microbica” ed è stato osservato che tutti gli organismi necessitano per la crescita di fonti di N, S e C. Quando un composto inorganico, come NO₃^‑, SO₄^2‑ e CO₂, viene ridotto per essere usato come nutriente si parla di assimilazione, e il processo riduttivo viene chiamato metabolismo assimilativo. È necessario sottolineare che il metabolismo assimilativo di NO₃^‑, SO₄ ^2‑ e CO₂, è molto diverso dai processi metabolici durante i quali questi composti vengono utilizzati come accettori di elettroni per la produzione di energia. Per distinguere questi due tipi di processi riduttivi, l'utilizzazione di questi composti come accettori di elettroni nel metabolismo energetico viene chiamato metabolismo dissimilativo.

Metabolismo assimilativo e dissimilativo sono molto diversi tra loro:

· nel metabolismo assimilativo viene ridotta solo la quantità di composto (NO₃^‑, SO₄ ^2‑ e CO₂) necessaria per soddisfare l'esigenza di nutrienti per la crescita, e gli atomi che subiscono la riduzione vengono incorporati in macromolecole e convertiti in materiale cellulare.

· nel metabolismo dissimilativo, viene ridotta una quantità molto maggiore del composto che viene utilizzato come accettore di elettroni e il prodotto di riduzione viene escreto dalla cellula nell'ambiente esterno.

Mentre molti organismi sono capaci di assimilare composti come NO₃^‑, SO₄ ^2‑ e CO₂ (per esempio, molti Batteri, Archea, funghi, alghe e piante superiori), solo un ristretto gruppo di microrganismi, quasi tutti procarioti, è in grado di compiere un metabolismo dissimilativo. Di seguito verranno discussi i principali tipi di metabolismo dissimilativo.

Riduzione del nitrato e denitrificazione

I composti inorganici dell'azoto sono tra i più comuni accettori di elettroni nella respirazione anaerobica. I composti inorganici dell'azoto più diffusi in natura sono l'ammoniaca e il nitrato, che si formano nell'atmosfera tramite reazioni chimiche, e l'azoto gassoso, N₂, che è anch’esso un gas atmosferico ed è la forma più stabile dell'azoto. La fissazione dell'azoto, cioè l'utilizzazione di N₂ come fonte di azoto per le biosintesi, sarà discussa più avanti in questo stesso capitolo.

Uno degli accettori di elettroni alternativi più comuni è il nitrato, NO₃^‑, che viene convertito nelle forme più ridotte NO, N₂O e N₂. Trattandosi di prodotti gassosi, questi composti vengono facilmente allontanati dall'ambiente; per questo motivo questo processo viene chiamato denitrificazione.

Nella maggior parte dei casi, il prodotto finale della riduzione dissimilativa del nitrato è N₂ o N₂O. La riduzione dissimilativa del nitrato è il prìncipale processo di formazione di N₂ per via biologica e, poiché l'azoto molecolare è una fonte di azoto molto meno facilmente utilizzabile per gli organismi viventi di quanto non lo sia il nitrato, l'intero processo è, dal punto vìsto agricolo, controproducente. Al contrario, per quanto riguarda il trattamento delle acque di scarico, il processo di denitrificazione è molto vantaggioso perché, convertendo NO₃^‑ a N₂, diminuisce significativamente la quantità di azoto disponibile negli effluenti, prevenendo la crescita di alghe.

Biochimica della riduzione dissimilativa del nitrato

L`enzima coinvolto nella prima reazione del processo di riduzione del nitrato, la nitrato reduttasi, è un enzima che contiene molibdeno. In generale, le nitrato reduttasi assimilative sono proteine solubili, la cui sintesi viene repressa dall'ammonio, mentre le nitrato reduttasi dissimilative sono proteine di membrana represse dall'ossigeno e sintetizzate solo in condizioni anossiche. Il processo di denitrificazione è, quindi, un processo strettamente anaerobico, mentre la riduzione assimilativa del nitrato può aver luogo senza alcun problema in condizioni aerobiche. La riduzione assimilativa del nitrato avviene in tutte le piante e nella maggior parte dei funghi come pure in molti procarioti, mentre la riduzione dissimilativa del nitrato è un processo che avviene soltanto nei procarioti, anche se sono molti i procarioti che lo possono attuare.

In entrambi i processi, il primo prodotto della riduzione del nitrato è il nitrito, NO₂^‑, e un altro enzima, la nitrito reduttasi, è responsabile della reazione successiva. Nel processo di riduzione dissimilativa sono possibili due vie alternative:

· una porta alla formazione di ammoniaca

· l'altra porta alla formazione di N₂.

La via che porta alla formazione di ammoniaca è utilizzata da molti batteri, ma è di minore importanza pratica. Esistono anche alcuni batteri che non sono in grado dì ridurre il nitrato ma possono ridurre il nitrito ad ammoniaca. In quest`ultimo caso, tuttavia, la riduzione potrebbe rappresentare un meccanismo di detossificazione, dato che in ambiente acido il nitrito può essere tossico (l'acido nitroso è un potente mutageno). La via che conduce alla formazione di azoto molecolare procede attraverso due intermedi gassosi, l'ossido nitrico (NO) e l'ossido nitroso (N₂O). Sono noti diversi organismi che producono solo N₂O durante il processo di denitrificazione, mentre altri organismi producono N₂ come prodotto gassoso finale. Nel ciclo dell'azoto, la formazione di composti gassosi dell'azoto da parte dei batteri denitrificanti. è molto importante ed è quìndi oggetto di molti studi.

La biochimica della riduzione del nitrato è stata studiata in dettaglio in Escherichia coli, un organismo capace di compiere soltanto la prima parte del processo, cioè la riduzione di NO₃^- a NO₂^-. La nitrato reduttasi è un enzima di membrana capace di accettare elettroni da un citocromo b quando nell'ambiente è assente O₂. Nelle figure sotto sono confrontate le catene di trasporto di elettroni di E.coli

che intervengono nel metabolismo aerobico e nella respirazione dei nitrati. A causa del potenziale di ossidoriduzione della coppia NO₃^-/NO₂^- (piu` basso di quello della coppia O₂/H₂O) durante la riduzione del nitrato viene trasferito soltanto un protone invece dei due che vengono trasferiti durante la respirazione aerobica.

Isolamento di batteri denitrificanti

L`allestimento di colture di arricchimento per l'isolamento di batteri denitrificanti è molto semplice e diretto. Viene infatti usato un terreno di coltura a composizione definita a cui viene aggiunto nitrato di potassio come accettore di elettroni e il tutto viene incubato in condizioni anaerobiche. Come fonte di energia (donatore di elettroni) deve essere utilizzato un composto che non sia facilmente fermentabile, di modo che non vengano selezionati organismi fermentanti. Fonti di energia adatte a questo scopo sono l'etanolo, l'acetato, il succinato o il benzoato. Dato che la maggior parte degli organismi denitrificanti sono anaerobi facoltativi, non è necessario che le condizioni di anaerobiosi siano molto rigorose. È sufficiente che la beuta sia chiusa in modo tale da impedire scambi gassosi con l’ ambiente esterno, così che l'ossigeno residuo nel terreno venga rapidamente utilizzato e la popolazione sia quindi costretta a passare alla respirazione anaerobica. La torbidità della coltura indicherà che è avvenuta crescita. Se viene prodotto azoto gassoso è possibile che al di sotto del tappo compaiano delle bolle di gas. I batteri che più frequentemente vengono arricchiti usando questa tecnica sono solitamente specie di Pseudomonas, come ad esempio Pseudornonas_fluorescens.

Riduzione del solfato

Diversi composti inorganici dello zolfo possono fungere da accettori di elettroni nella respirazione anaerobica. Il solfato, la forma più ossidata dello zolfo, è uno dei principali anioni presenti nell'acqua marina e viene utilizzato dai batteri solfato‑riduttori, un gruppo ampiamente distribuito in natura. Il prodotto finale della riduzione dei solfati è H₂S, un importante prodotto naturale che prende parte a molti processi biogeochimici. Anche nel caso dei solfati è importante distinguere tra riduzione assimilativa e riduzione dissimilativa. Diversi organismi, tra cui le piante superiori, le alghe, i funghi e la maggior parte dei procarioti possono usare il solfato come fonte di zolfo per le biosintesi. La possibilità di utilizzare il solfato come accettore di elettroni nei processi di generazione dell'energia è invece ristretta ad un gruppo particolare di batteri anaerobi obbligati, i batteri solfato‑riduttori.

Come è mostrato dai potenziali di riduzione, il solfato è un accettore di elettroni molto meno favorevole sia del nitrato che dell'ossigeno molecolare. Comunque, il suo potenziale di ossidoriduzione è sufficiente per produrre ATP quando viene utilizzato un donatore di elettroni da cui venga prodotto NADH o FADH. Proprio a causa del potenziale meno favorevole, gli organismi che utilizzano il solfato hanno una resa di crescita molto inferiore a quella di organismi che utilizzano l'ossigeno o il nitrato. H₂, lattato e piruvato, sono utilizzati da molti batteri solfato ‑riduttori, mentre gli altri sono utilizzati da un gruppo più ristretto. I batteri solfato‑riduttori non appartengono ad un unico gruppo, ma a tipi morfologici e fisiologici diversi.

Biochimica ed energetica della riduzione del solfato

La riduzione biochimica del solfato a solfuro d'idrogeno richiede 8 elettroni e procede attraverso diversi stadi intermedi. Lo ione solfato è piuttosto stabile e non può essere utilizzato senza prima essere attivato. L'attivazione del solfato avviene mediante l'uso di ATP. L`enzima ATP solforilasi catalizza l'esterificazione del solfato con un gruppo fosfato dell'ATP portando alla formazione di adenosilfosfosolfato, APS. Nella riduzione dissimilativa del solfato, il gruppo solfato dell'APS viene ridotto direttamente a solfito (SO₃ ^2‑), mentre nella riduzione assimilativa un altro gruppo fosfato viene aggiunto all'APS a formare il fosfoadenosilfosfosolfato (PAPS), e solo a questo punto il solfato può essere ridotto. In entrambi i casi, il primo prodotto della riduzione del solfato è il solfito, SO₃^2‑,una volta formato il solfito, le riduzioni seguenti procedono rapidamente. Molti organismi sono capaci di ridurre il solfito, o per detossificarlo (il solfito è piuttosto tossico) o per utilizzarlo come accettore di elettroni. Nella riduzione assimilativa dei solfati, il solfuro d'idrogeno, H₂S, che viene prodotto viene immediatamente convertito in zolfo organico, per esempio sotto forma di aminoacidi, mentre nella riduzione dissimilativa viene escreto. Nei batteri solfato‑riduttori, gli elettroni vengono trasferiti dalla fonte di energia al solfato dell'APS ad opera di citocromi. Il citocromo dei batteri solfato‑riduttori è un tipo particolare di citocrorno a basso potenziale, chiamato citocromo c₃, che non è mai stato trovato in organismi che usano accettori di elettroni diversi dal solfato. Gli altri trasportatori di elettroni nella catena respiratoria dei batteri solfato‑riduttori comprendono ferredossine e flavodossine. I solfato‑riduttori del Tipo II (cioé le specie capaci di degradare l'acetato e altri acidi grassi) contengono anche un citocromo di tipo b, probabilmente coinvolto nella catena di trasporto degli elettroni; il citocrorno b è assente nelle specie di solfato‑riduttori che non degradano gli acidi grassi. Il sistema di trasporto degli elettroni nei solfato‑riduttori è illustrato nella Figura sotto.

Nella catena di trasporto di elettroni dei batteri solfato‑riduttori l'idrogeno, H₂, di origine ambientale o generato dall'ossidazione di donatori di elettroni organici, trasferisce elettroni all'enzima idrogenasi, che è localizzato nel periplasma e strettamente associato al citocromo c₃. A causa della disposizione spaziale dei trasportatori nella membrana, quando gli atomi di idrogeno dell'idrogeno molecolare H₂ vengono ossidati, i protoni (H⁺) rimangono all'esterno della membrana, mentre gli elettroni vengono trasferiti attraverso la membrana. In questo modo si crea una forza motrice dei protoni che può essere sfruttata per la sintesi di ATP. Nel citoplasma gli elettroni vengono utilizzati per la riduzione dell'APS.

Quando i batteri solfato‑riduttori crescono a spese di H₂ e SO₄^2‑, si comportano da chemiolitotrofi come gli idrogeno‑batteri. In queste condizioni alcune specie possono crescere anche in modo autotrofico, utilizzando la CO₂ come unica fonte di carbonio. La maggior parte dei batteri solfato‑riduttori è, però, chemiorganotrofa e utilizza diversi composti organici come donatori di elettroni .

Crescita dei batteri solfato-riduttori utilizzando acetato

Sono noti molti batteri solfato‑riduttori capaci di crescere utilizzando l'acetato come unica fonte di energia; per la maggior parte si tratta di organismi marini. Questi batteri ossidano completamente l'acetato a CO₂ e riducono il solfato a solfuro:

acetato‑ + SO₄ ^2‑ + 3H⁺ ‑‑‑> 2CO₂ + H₂S + 2H₂O

DGº' = ‑57,5 kj/reazione

Il ciclo degli acidi tricarbossilici, che negli organismi viventi è la principale via biochimica attraverso la quale viene ossidato l'acetato, non è funzionale nei batteri solfato‑riduttori che ossidano l'acetato. Al suo posto sono attivi due diversi meccanismi biochimici per l'ossidazione dell'acetato: un ciclo degli acidi tricarbossilici modificato e la via dell'acetil‑CoA.

Organismi come Desulfobacter utilizzano, per l'ossidazione dell'acetato, il ciclo dei TCA modificato. In questo ciclo modificato vengono utilizzati solo una parte degli enzimi del ciclo classico dei TCA. Desulfolbacter possiede un enzima che in primo luogo attiva l'acetato mediante una reazione con il succinil‑CoA e che porta alla formazione di succinato e acetil‑CoA; quest'ultimo entra quindi nel ciclo dei TCA e viene ossidato a CO₂.

Come abbiamo detto in precedenza, dato che la coppia SO₄ ^2‑/SO₃^2‑ ha un basso potenziale dì ossidoriduzione, nel primo passaggio della riduzione del solfato è richiesta energia. Questa richiesta di energia crea un problema particolare ai batteri solfato‑riduttori che ossidano l'acetato; infatti, la resa in ATP derivante dall'ossidazione dell'acetato attraverso il ciclo modificato dei TCA è all'incirca uguale alla quantità di energia richiesta per l'attivazione del solfato in APS. Ciò che permette la sintesi netta di ATP (e quindi la crescita), utilizzando acetato, è la presenza, in Desulfobacter, di un enzima particolare, la citrato liasi, che è in grado di accoppiare, durante la produzione del citrato, la sintesi di ATP mediante fosforilazione a livello del substrato, con la conversione dell'acetil‑CoA (via acetil‑P) ad acetato. L`ATP aggiuntivo che viene prodotto attraverso questa via rende possibile la crescita utilizzando acetato.

La maggior parte dei batteri solfato‑riduttori che ossidano l'acetato non usano il ciclo modificato dei TCA per l'ossidazione dell'acetato, ma utilizzano invece la via dell'acetil‑CoA. Questa via viene utilizzata per ossidare l'acetato a CO₂ attraverso una serie di reazioni diverse da quelle del ciclo dei TCA, mediante l'utilizzazione dell'enzima monossido di carbonio deidrogenasi. Questa via biochimica fu evidenziata per la prima volta nei batteri omoacetogeni, e solo in un secondo tempo si scoprì che era presente anche nei batteri solfato‑riduttori.

L`anidride carbonica come accettore di elettroni

L`anidride carbonica, CO₂, è molto comune in natura ed è il principale prodotto del metabolismo energetico dei chemiorganotrofi. Diversi gruppi di procarioti possono usare l'anidride carbonica come accettore di elettroni nella respirazione anaerobica; il gruppo più importante è quello dei metanogeni, appartenenti agli Archea. Alcuni metanogeni utilizzano H₂ come donatore di elettroni (fonte di energia); la reazione complessiva è:

4H₂ + H⁺ + HCO₃^‑ ‑‑‑> CH₄ + 3H₂O

DGº' = ‑135,6 kj/reazione

Quando i metanogeni crescono a spese dì H₂ e CO₂ si comportano come chemiolitotrofi autotrofi,il processo attraverso il quale viene fissata la CO₂ non è, però, il convenzionale ciclo di Calvin proprio della maggior parte degli autotrofi, ma la via dell'acetil‑CoA. Un altro gruppo di batteri che utilizzano la CO₂ nella respirazione anaerobica sono i batteri omoacetogeni che producono acetato (invece di CH₄) a partire da H₂ e O₂. La reazione complessiva dell'omoacetogenesi è la seguente:

4H₂ + H⁺ + 2HCO₃^‑ ‑‑> CH₃‑COO^‑ + 4H₂O

DGº' = ‑1O4,6 kj/reazione

Dal punto di vista tassonomico i batteri omoacetogeni non sono un gruppo definito; essi, infatti, comprendono organismi molto diversi tra loro, come lo sporigeno Gram‑positivo Clostridium aceticum e il Gram-negativo non sporigeno Acetobacterium woodii.

Se confrontiamo le due reazioni sopra riportate, appare chiaro che durante la formazione del metano si libera una maggiore quantità di energia rispetto a quella che si libera durante la formazione dell'acetato. Quando crescono soltanto a spese dì H₂ e CO₂, sia ì metanogenì che gli omoacetogeni si comportano da autotrofi (e possono anche essere considerati dei chemiolitotroti). Inoltre, entrambi i gruppi sono anaerobi obbligati. Bisogna sottolineare, comunque, che il metabolismo dei metanogeni non è ristretto all'uso di idrogeno e anidride carbonica; molti metanogeni, infatti, crescono e formano metano a spese di metanolo, acido formico e acetato. Per quanto riguarda gli omoacetogeni, la maggior parte di essi può anche comportarsi da chemiorganotrofi, ricavando l'energia per la crescita dalla fermentazione degli zuccheri.

La bioenergetica della sintesi di ATP nei metanogeni e negli omoacetogeni viene tuttora attivamente studiata. Per quanto riguarda la metanogenesi a partire da ídrogeno e anidride carbonica, vi sono evidenze che suggerìscono che la sìntesì di ATP avvenga grazìe alla formazione di un gradiente protonico. Negli omoacetogeni si pensa che possa avvenire sia la fosforilazione ossidativa che la fosforilazione a livello del substrato.

Altri accettori di elettroni nella respirazione anaerobica

Oltre al nitrato, al solfato e all'anidride carbonica, esistono parecchi altri composti, sia organici che inorganici, che possono essere usati da gruppi diversi di batteri come accettori di elettroni nella respirazione anaerobica. In questo paragrafo verranno discussi i più importanti di questi composti.

Riduzione del ferro ferrino

Il ferro ferrico (Fe³⁺) può essere ridotto a ferro ferroso (Fe²⁺) da diversi microrganismi e, dato che Fe³⁺ è piuttosto abbondante in molti habítat microbici, la sua riduzione può rappresentare una forma molto importante dì respìrazìone anaerobica. Il ferro ferrico può fungere da accettore di elettroni per il metabolismo energetico di alcuni funghi e di diversi batteri chemiorganotrofi e chemiolitotrofi. Dato che il potenziale di ossidoriduzione della coppia Fe³⁺/ Fe²⁺ è molto alto (Eº'= O,77 volt), la riduzione del ferro ferrico può essere accoppiata all'ossidazione di molti donatori di elettroni sia organici che inorganici. Diversi composti organici, compresi alcuni composti aromatici, possono essere ossidati in ambiente anaerobico da batteri che riducono il ferro ferrico; si presume che, in questo caso, gli elettroni arrivino a un sistema reduttasico specifico per il ferro ferrico tramite una catena di trasporto di elettroni. Questo flusso di elettroni stabilirebbe un gradiente protonìco sfruttato per la produzione dì ATP. La maggior parte delle ricerche relative all'energetica della riduzìone del ferro ferrico sono state condotte nel batterio Gram negativo Shewenella putrefaciens, che può sfruttare diversi donatori organici di elettroni per la crescita in anaerobiosi con Fe³⁺ come accettore finale di elettroni.

Il ferro ferrico è uno dei metalli più comuni nei suoli e nelle rocce, e la sua riduzione porta alla produzione di ferro ferroso che è una forma più solubile di questo metallo. La riduzione batterica del ferro ferrico è quindi un importante processo biogeochimico in quanto porta alla solubilizzazìone del ferro. L`attività dei microrganismi che riducono il ferro ferrico può portare alla formazione di particolari tipi di depositi di ferro.

Riduzione del manganese

Il manganese può esistere in diversi stati di ossidazione, dei quali i più stabili e biologicamente rilevanti sono Mn⁴⁺ e Mn²⁺. La riduzione anaerobica del Mn⁴⁺ a Mn²⁺ è effettuata da diversi microrganismi, per lo più chemiorganotrofi. Nella maggior parte dei casi è, però, difficile dimostrare che la riduzione di Mn⁴⁺ è energeticamente vantaggiosa, perché in diversi organismi può avvenire anche una riduzione fortuita di Mn⁴⁺. L`utilizzazione di manganese nella respirazione anaerobica è stata comunque dimostrata in S. putrefaciens e in pochi altri batteri che sono capaci di crescere in anaerobiosi utilizzando l'acetato e diverse altre fonti di carbonio non fermentabili, avendo a disposizione solo Mn⁴⁺ come possibile accettore di elettroni. Questo dato suggerisce che è possibile una respirazione anaerobica che sfrutta la riduzione del Mn⁴⁺, e che per la produzione di energia viene sfruttata probabilmente una forza motrice dei protoni formata durante il trasporto degli elettroni dal donatore all'accettore.

Accettori di elettroni organici

Diversi composti organici possono fungere da accettori di elettroni nella respirazione anaerobica. Bisogna ricordare che i composti organici possono fungere da accettori di elettroni anche in un metabolismo di tipo chemiorganotrofo convenzionale; tuttavia, in questi casi, come per esempio durante le fermentazioni, l'accettore di elettroni organico viene prodotto all'ínterno dell'organismo durante il processo metabolico stesso e viene ridotto sempre all'interno dell'organísmo. Nel caso della respirazione anaerobica, invece, i composti organici che servono come accettori di elettroni provengono dall'ambiente esterno. Ancora più importante, nella fermentazíone non vi è trasporto di elettroni accoppiato alla fosforilazione ossidativa, come invece avviene nella respirazione anaerobica.

Tra i composti organici più studiato è il fumarato, che viene ridotto a succinato. Esaminando il ciclo degli acidi tricarbossilici, ci si accorge immediatamente che fumarato e succinato sono importanti intermedi del ciclo. Il fumarato può fungere da accettore di elettroni nella respirazione anaerobica perché la coppia fumarato/succinato ha un potenziale di ossidoriduzione (circa O volt) sufficiente per l'accoppiamento della riduzione del fumarato con l'ossidazione del NADH. La resa energetica è sufficiente per la sintesi di 1 ATP. Tra i batteri capaci di usare il fumarato come accettore di elettroni ricordiamo Wolinella succinogenes (che può crescere utilizzando H₂ come unica fonte di energia e fumarato come accettore di elettroni), Desulfovibrio gigas (un batterio solfatoriduttore che può crescere anche in assenza di solfati), alcuni clostridi, Escherichia coli e Proteus rettgeri. Un altro batterio, Streptococcus faecalis, può usare il fumarato come accettore di elettroni, ma non è in grado di accoppiare la sua riduzione alla fosforilazione ossidativa; in questo caso il fumarato serve soltanto per riossidare il NADH formato durante la glicolisi.

Anche l'ossido di trimetilammina (TMAO) è un interessante accettore di elettroni. Questo composto è un importante osmoregolatore nei pesci marini, che lo utilizzano come mezzo per l'escrezione dell'azoto in eccesso; diversi batteri possono ridurre il TMAO a trimetilammina (TMA). La TMA ha un odore molto forte, e parte del cattivo odore che si avverte frequentemente nei pesci di mare è proprio dovuto alla produzione batterica di TMA. Diversi batteri anaerobi facoltativi possono utilizzare il TMAO come accettore alternativo di elettroni. Anche diversi batteri rossi fototrofi possono usare il TMAO come accettore di elettroni durante il metabolismo anaerobico al buio. Un composto analogo al TMAO è il dimetilsolfossido (DMSO), che viene ridotto a dimetilsolfuro (DMS) da diversi batteri. Il DMSO è un prodotto naturale comune, che può essere trovato sia nelle acque dolci che in quelle marine. Il DMS ha un odore forte e pungente, la sua presenza indica che è avvenuta o sta avvenendo la riduzione batterica del DMSO. Diversi batteri, tra cui Campylobacter, Escherichia e molti batteri rossi fototrofi, sono capaci di utilizzare il DMSO come accettore di elettroni nel metabolismo energetico.

Le coppie TMAO/TMA e DMSO/DMS hanno potenziali di ossidoriduzione simili, circa +O,15 volt, ciò significa che qualunque catena di trasporto di elettroni che termini con TMAO o con DMSO deve essere piuttosto breve. Nella maggior parte dei casi in cui viene ridotto il TMAO o il DMSO, un cìtocromo di tipo b (con un potenziale di ossidoriduzione di circa O volt), è stato identificato come ossídasí terminale.

Fermentazioni

Dato che l'ossigeno non è molto solubile, molti ambienti diventano facilmente anossici. In ambienti anossici la degradazione della materia organica avviene tramite metabolismi anaerobici. Se in un ambiente anaerobico non sono disponibili gli accettori di elettroni che abbiamo trattato nella sezione precedente, la maggior parte della materia organica verrà catabolizzata mediante fermentazioni. Il processo globale di una fermentazione è stato discusso e abbiamo visto che la fermentazione è un processo ossidoriduttivo bilanciato al suo interno, durante il quale lo stesso composto organico viene in parte ridotto e in parte ossidato.

Quando un organismo catabolizza un composto organico in un metabolismo energetico deve affrontare due problemi: (1) conservare, convertendola in ATP parte dell'energia liberata durante il processo, e (2) eliminare gli elettroni rimossi dal donatore di elettroni. Nelle fermentazioni l'ATP viene di solito generato mediante fosforilazione a livello del substrato, un meccanismo attraverso il quale gruppi fosforici con legami altamente energetici vengono trasferiti dagli intermedi organici della fermentazione all'ADP. Il secondo problema, cioè il bilancio ossidoriduttivo, viene risolto dall'organismo producendo e secernendo i prodotti finali della fermentazione generati dal substrato di partenza. In questo paragrafo prenderemo in considerazione i principi basilari della fermentazione, dandone una descrizione più dettagliata e metteremo in evidenza le grandi differenze che intercorrono tra le fermentazioni finora note.

Composti ad alta energia e fosforilazione a livello del substrato

Vi sono molti modi diversi per ottenere energia tramite la fosforilazione a livello del substrato. In ogni caso, per la sintesi di ATP è fondamentale la produzione di composti ad alta energia. Generalmente si tratta di composti organici a cui è legato un gruppo fosfato o una molecola di coenzima‑A, la cui idrolisi è altamente esoergonica. La fosforilazione a livello del substrato è un modo per generare ATP più diretto di quanto non sia una forza motrice dei protoni, ma richiede che la fonte di energia possa essere direttamente accoppiata a un intermedio ad alta energia.

Resa energetìca degli organismi fermentanti

Quanto ATP può produrre un organismo fermentante? Come abbiamo già visto, un organismo che fermenta il glucosio può produrre 2‑3 moli di ATP per mole di glucosio fermentata. Questa è più o meno la quantità massima di ATP che può venire prodotta nella fermentazione del glucosio; altri substrati generano una quantità di energia inferiore. La quantità teorica di energia, che può essere liberata in una particolare fermentazione, può essere calcolata conoscendo l'equazione bilanciata della fermentazione e i relativi valori di energia libera. Per esempio, la fermentazione del glucosio a etanolo e CO₂ ha una resa energetica teorica di ‑235 kJ/mole, sufficiente a generare 7 moli di ATP. In realtà vengono prodotte solo due moli di ATP, il che significa che l'organismo opera con un'efficienza considerevolmente inferiore alla massima possibile.

Fermentazioni senza fosforilazione a livello del substrato

Il catabolismo di certe sostanze non libera una quantità di energia sufficiente per l'accoppiamento con la sintesi di ATP mediante fosforilazione a livello del substrato, ciò nonostante questi composti sono in grado di consentire la crescita fermentativa di un organismo. In questi casi, il catabolismo del substrato è collegato a una pompa ionica che determina la formazione di un gradiente di protoni o di ioni sodio attraverso la membrana. Esempi di questo tipo di metabolismo comprendono la fermentazione di Propionigenium modestum e Oxalobacter formigenes; entrambi questi organismi accoppiano la fermentazione di acidi carbossilici a una pompa ionica di membrana, coinvolta nella produzione di energia. La reazione complessiva della fermentazione di P.modestum è la seguente:

Succinato^2‑ + H₂O ‑> propionato‑ + HCO₃^-

DGº' = ‑2O,5 kj/reazione

L`energia liberata nella reazione è insufficiente per l'accoppiamento diretto con la sintesi di ATP mediante fosforfiazione a livello del substrato, tuttavia viene utilizzata dal microrganismo come unica reazione energetica per la crescita. Ciò è possibile perché in P.modestum la decarbossilazione del succinato è accoppiata al trasporto di Na⁺ all'esterno, attraverso la membrana plasmatica (Figura a fianco a ).

Una ATPasi di membrana Na⁺ dipendente sfrutta il gradiente di ioni Na⁺ per la sintesi di ATP (Figura a). O.formigenes fermenta l'ossalato:

Ossalato^2‑ + H₂O ‑‑> formiato^‑ + HCO₃^-

DGº' = ‑26,7 kj/reazione

A pH neutro l'ossalato esiste nella forma ionica ossalato^2‑ e la sua decarbossilazione a formiato‑ consuma un protone. La successiva escrezione di formiato dalla cellula determina, quindi, la formazione di un gradiente protonico che può essere accoppiato alla sintesi di ATP grazie ad una ATPasi di membrana che trasloca protoni (Figura b).

Un`aspetto interessante e particolare del metabolismo di P. modestum e di O. formigenes risiede nel fatto che la sintesi di ATP avviene senza che vi sia fosforilazione a livello del substrato e senza che vi sia trasporto di elettroni; la formazione di ATP è dovuta all'attività della pompa Na⁺ o H⁺ collegata all'escrezione di acidi organici. Risulta quindi chiaro che una reazione che produce meno delle 31,8 kj/mole necessarie per la sintesi di 1 ATP o che sembra non poter essere accoppiata alla fosforilazione a livello del substrato, non deve essere automaticamente scartata come potenziale reazione energetica sfruttabile dal batterio per la sua crescita. Se la reazione può essere accoppiata a un gradiente ionico, la produzione di ATP (e quindi la crescita) potrebbe essere comunque possibile.

Bilanciamento ossido-riduttivo

In qualunque fermentazione deve essere mantenuto un bilanciamento tra ossidazioni e riduzioni. Il numero totale di elettroni nei prodotti che compaiono nella parte destra dell'equazione deve essere uguale al numero di elettroni nei substrati che compaiono nella parte sinistra dell'equazione. Quando in laboratorio si studia sperimentalmente una fermentazione è pratica comune calcolarne il bilanciamento per accertarsi di non aver trascurato alcun prodotto. Il bilanciamento della fermentazione può anche essere calcolato teoricamente a partire dallo stato di ossidazione dei substrati e dei prodotti.

In diverse fermentazioni il bilancio ossidoriduttivo viene mantenuto producendo idrogeno molecolare, H₂. Nella produzione di H₂, gli accettori di elettroni sono i protoni (H⁺) derivati dall'acqua. Generalmente, la produzione di H₂ è associata alla presenza nell'organismo di una proteina ferro‑zolfo chiarata ferredossina, un trasportatore di elettroni a basso potenziale di ossido riduzione. Il trasferimento di elettroni dalla ferredossína a H⁺ è catalizzato dall'enzima idrogenasi. In precedenza, abbiamo già discusso dell'enzima idrogenasi in relazione all'utilizzazione di idrogeno da parte dei batteri solfato‑riduttori. In questo caso invece l'idrogenasi è coinvolta nella produzione di idrogeno.

In realtà, l'energetica della produzione di idrogeno è piuttosto sfavorevole, di modo che la maggior parte degli organismi fermentanti produce, insieme con gli altri prodotti della fermentazione, solo piccole quantità di idrogeno. La produzione di idrogeno, quindi, serve soprattutto a mantenere il bilancio ossidoriduttivo. Se, per esempio, la riduzione di idrogeno viene impedita, il bilancio ossidoriduttivo degli altri prodotti della fermentazione verrà spostato verso la formazione di prodotti più ridotti. La maggior parte degli organismi fermentanti che producono idrogeno producono anche etanolo e acetato. Dato che l'etanolo è più ridotto dell'acetato, la sua formazione sarà favorita quando è inibita la formazione di idrogeno.

Diversi batteri producono, tra i prodotti della fermentazione, acetato. La produzione di acetato è energeticamente vantaggiosa perché consente all'organismo di produrre altro ATP sempre mediante fosforilazione a livello del substrato, in aggiunta a quello già prodotto nelle fasi precedenti. L`intermedio fondamentale generato durante la produzione dell'acetato è l'acetil‑CoA, un intermedio ad alta energia. L`acetil‑CoA può essere convertito in acetilfosfato, il cui gruppo fosfato ad alta energia può essere poi trasferito, ad opera dell'acetato chinasi, all'ADP con formazione di ATP e acetato. Il piruvato, che è il principale prodotto della glicolisi, è uno dei più importanti substrati che vengono convertiti ad acetil‑CoA. Comunque, dato che la conversione del piruvato ad acetil‑CoA è una ossidazione (il piruvato è infatti più ridotto dell'acetil‑CoA), l'eccesso di elettroni che si genera deve essere usato per produrre o H₂, come abbiamo visto in precedenza, o prodotti finali più ridotti.

Diversità delle fermentazioni

Le fermentazioni possono essere classificate o in base ai substrati fermentati o in base ai prodotti finali della fermentazione. In questo paragrafo verrà presentata una panoramica delle fermentazioni più comuni.

Nella Tabella sono riassunti i principali tipi di fermentazioni, classificate in base ai prodotti formati.

Inserire tabella

E` da notare che alcune fermentazioni hanno una gamma piuttosto ampia di prodotti finali. Diverse fermentazioni vengono classificate in base al substrato fermentato piuttosto che in base ai prodotti formati. Per esempio, per molti batteri sporigeni anaerobi (genere Clostridium) si parla di fermentazione di amínoacidi, i cui prodotti finali sono l'acetato, il lattato, l'ammoniaca e H₂. Altre specie di clostridi, come C. acidi‑urici e C. purynolíticum, fermentano le purine come la xantina o l'adenina, con produzione di acetato, formiato, ammoniaca e anidride carbonica. Altri anaerobi fermentano i composti aromatici. Ad esempio, Pelobacter acidigallici fermenta il floroglucinolo (1,3,5‑triidrossibenzene, C₆H₃(OH)₃); la reazione complessiva è la seguente:

Floroglucinolo (C₆H₆O₃) + 3H₂O ‑‑‑> 3acetato‑ + 3H⁺

DGº' = ‑142,5 kJ/reazione

Sono note anche fermentazioni insolite, attuate soltanto da gruppi molto ristretti di anaerobi o, in alcuni casi, da un'unica specie batterica.. Il metabolismo di questi organismi può essere considerato altamente specializzato, avendo essi evoluto vie biochimiche per il catabolismo di substrati che non possono essere utilizzati da altri microrganismi. Comunque, perché anche questi substrati particolari possano venire fermentati è necessario, come lo era per i substrati più comuni riportati nella Tabella, che l'organismo possa produrre durante il processo catabolico un intermedio ad alta energia, generalmente un derivato del coenzima A, da cui il microrganismo possa ricavare energia sotto forma di ATP

Il metano come prodotto finale dei processi dì decomposizione anaerobica

Molti dei prodotti delle fermentazioni possono a loro volta servire da fonti di energia per altri microrganismi fermentanti. Microrganismi anaerobi capaci di utilizzare i prodotti delle fermentazioni di altri microrganismi possono condividere un unico ambiente in cui avvengono diverse fermentazioni. Per esempio, il succinato, il lattato e l'etanolo, prodotti dalla fermentazione degli zuccheri, possono essere a loro volta fermentati da altri microrganismi. La fermentazione di questi "prodotti di fermentazione" porta, alla fine, alla formazione di acetato, H₂ e CO₂, che fungono da substrato per gli Archea metanogeni. Vi sono invece due prodotti che non possono essere ulteriormente fermentati: questi prodotti sono CO₂ e CH₄, cioe` la forma rispettivamente più ossidata e più ridotta del carbonio. 1 prodotti finali della decomposizione anaerobica sono quindi CH₄ e CO₂. Tutti i processi di decomposizione anaerobica portano, alla fine, a questi due composti, uno ridotto e l'altro ossidato, del carbonio.

Fermentazioni accoppiate

Anche se una fermentazione non è energeticamente favorevole, può comunque venire effettuata da un organismo se il prodotto finale, soprattutto H₂, può essere usato da un altro organismo in un processo metabolico energeticamente favorevole. Questo fenomeno, in cui due organismi ricavano energia da reazioni biochimiche che considerate separatamente non sarebbero vantaggiose, viene chiamato sintrofia (nutrizione reciproca). Uno dei sistemi sintrofici più studiati nel metabolismo fermentativo riguarda la fermentazione dell'etanolo ad acetato e metano da parte di due organismi, uno che fermenta l'etanolo e uno metanogeno. Come si può vedere, l'organismo che fermenta l'etanolo produce idrogeno e acetato, ma la resa energetica di questa reazione è sfavorevole (segno positivo). L`idrogeno prodotto però viene consumato dal metanogeno in una reazione energeticamente favorevole. Sommando l'energia liberata in queste due reazioni, il bilancio complessivo è energeticamente favorevole. E` importante notare che il metanogeno non è di per sé capace di utilizzare l'etanolo, e che quindi entrambi gli organismi traggono un vantaggio dall'associazione.

I limiti del catabolismo anaerobico: composti recalcitranti

E` generalmente riconosciuto che i microrganismi siano estremamente versatili nella degradazione delle sostanze organiche. Esistono, tuttavia, dei limiti a questa versatilità; infatti, non tutti i composti organici possono essere degradati in anaerobiosi ed esistono alcune sostanze naturali che sono stabili in condizioni aerobiche.

Vi sono due gruppi di composti organici naturali che sembrano essere particolarmente refrattari alla degradazione per via fermentativa: la lignina e gli idrocarburi. La lignina è un polimero molto complesso costituito da gruppi fenilpropanoidi legati tra loro da legami C‑C e C‑O‑C (eteri). La lignina è il principale costituente del legno ed è responsabile della rigidità della parete di cellulosa delle piante legnose. La lignina sembra essere completamente inattaccabile tramite metabolismi anaerobici e in habitat anossici non viene degradata. In condizioni anaerobiche il prodotto finale che deriva dalle piante legnose è il carbone, che non esisterebbe se la lignina non fosse stabile in ambienti anossici.

Un’altro gruppo di sostanze organiche naturali refrattarie alla fermentazione è costituito dagli idrocarburi alifatici a catena lunga, come l'esadecano (C₁₆H₃₄) e l'ottadecano (C₁₈H₃₈). Questi idrocarburi, che sono tra i principali costituenti del petrolio, vengono prodotti o direttamente da piante e animali o vengono derivati chimicamente per riduzione degli acidi grassi a catena lunga. Non essendo fermentabili, in ambienti naturali anossici questi idrocarburi sono molto stabili e costituiscono la base del petrolio, fondamentale nella società moderna. Pur non essendo fermentabili, gli idrocarburi saturi possono venire degradati in condizioni anaerobiche, anche se molto lentamente, da alcuni batteri solfato‑riduttori.

Quando però la lignina o gli idrocarburi vengono in contatto con un ambiente ossigenico possono essere facilmente attaccati dai microrganismi. Quindi, nella biosfera questi composti sono stabili solo in condizioni anaerobiche.

Oltre a una vasta gamma di composti organici naturali, esistono molti composti organici, utilizzati nell'industria e nell'agricoltura, prodotti artificialmente mediante sintesi chimica. Alcuni composti di sintesi sono abbastanza simili ai composti naturali, mentre altri sono chimicamente molto diversi da qualunque composto prodotto da organismi viventi. Questi ultimi sono particolarmente interessanti per il microbiologo perché, non essendo mai esistiti in natura, potrebbero non essersi evoluti microrganismi capaci di degradarli.

Composti di questo tipo vengono chiamati xenobiotici (estranei ai viventi). Accurate ricerche hanno comunque dimostrato che, in alcuni casi, certi composti xenobiotici possono essere degradati, ma soltanto da consorzi di microrganismi e non da una coltura pura. Per esempio, alcuni idrocarburi clorurati possono essere declorurati solo in condizioni anaerobiche mentre l'intermedio che viene prodotto può essere ulteriormente metabolizzato solo in condizioni aerobiche.

Metabolismo dell’azoto

I microrganismi possono ottenere l'azoto necessario per le biosintesi o a partire da forme organiche o a partire da forme inorganiche di questo elemento. Le fonti più comuni di azoto inorganico sono il nitrato e l'ammoniaca, ma esistono microrganismi capaci di utilizzare anche fonti meno convenzionali come il cianuro (CN^‑), il cianato (OCN^‑), il tiocianato (SCN^‑), la cianammide (NCN^2‑), il nitrito (NO^2-) e l'idrossilammina (NH₂OH). Come vedremo nella sezione seguente, diversi batteri sono capaci di utilizzare anche l'azoto gassoso (azoto molecolare, N₂)

Enzimi come le transaminasi e come le aminoacido deidrogenasi catalizzano l'assimilazione riduttiva dell'ammoniaca di origine ambientale. Un'altra via molto importante per l'assimilazione dell'ammoniaca è quella in cui interviene la glutammina sintetasi. Questo enzima catalizza l'incorporazione di ammoniaca nel glutammato con formazione dì glutammina. In una seconda reazione, l'enzima glutammato sintasi catalizza il trasferimento del gruppo ammidico della glutammina all'a‑chetoglutarato formando due molecole di glutammato.

Sommando queste due reazioni il risultato netto è la conversione di una molecola di a‑chetoglutarato e una molecola di ammoniaca a una molecola di glutammato con consumo di una molecola di ATP. Oltre al ruolo svolto nell'assimilazione dell'ammoniaca, la glutammina serve anche come donatore del gruppo ammidico in diverse reazioni biosintetiche, come ad esempio per la sintesi delle purine.

La glutammina sintetasi è soggetta a un tipo di controllo metabolico molto interessante. L’enzima può esistere in due forme, una attiva e una inattiva. Alla forma inattiva è legato un residuo adenilico, fornito dall'ATP in un processo detto di adenilazione. L'adenilazione della glutammina sintetasi è favorita da elevate concentrazioni di ammoniaca e provoca l'inattivazione dell'enzima. Ciò fa sì che, in presenza di elevate concentrazioni di ammoniaca, l'assimilazione proceda tramite l'attività della glutammato deidrogenasi che, avendo una bassa affinità per l'ammoniaca, funziona solo in presenza di alte concentrazioni. Quando la concentrazione di ammoniaca diminuisce, la glutammina sintetasi viene deadenilata e torna ad essere attiva. Il controllo mediante adenilazione richiede una vera e propria modificazione covalente dell'enzima e non una semplice variazione della conformazione. Si presume che la funzione dell'adenilazione sia quella di prevenire un inutile consumo di ATP nella reazione catalizzata dalla glutammina sintetasì quando i livelli di ammoniaca sono sufficienti per l'attività della glutammico deidrogenasi; quest’ultima infatti non richiede ATP per la reazione. L’utilizzazione del nitrato e l'intero processo della riduzione assimilativa del nitrato sono già stati discussi in questo stesso capitolo.

Fissazione dell'azoto

L’utilizzazione di azoto gassoso (N₂) come fonte di azoto per le biosintesi viene chiamata fissazione dell'azoto e viene compiuta solo da alcuni organismi procariotici. Diversi organismi, sia anaerobi che aerobi, possono compiere questo particolare processo. Inoltre, vi sono alcuni batteri che fissano l'azoto solo quando sono in associazione con certe piante (azotofissatori simbionti). Per quanto è noto finora, non esistono organismi eucariotici capaci di fissare l'azoto. La fissazione simbiotica dell'azoto sarà discussa …...

Nitrogenasi

Nel processo di fissazione, l'azoto gassoso (N₂) viene ridotto ad ammoniaca, che verrà poi incorporata nei composti organici. Il processo di riduzione è catalizzato dal complesso enzimatico della nitrogenasi, costituito da due proteìne: la dinitrogenasi e la dinitrogenasi reduttasi. Entrambe contengono ferro e la dinitrogenasi contiene anche molibdeno. Nella dinitrogenasi ferro e molibdeno fanno parte di un cofattore (FeMoCo) attivamente coinvolto nella riduzione del N₂. Alcuni batteri azotofissatori possono, in condizioni di crescita particolari, sintetizzare più di un tipo di nitrogenasi; queste nitrogenasi alternative non contengono molibdeno, al suo posto si può trovare o vanadio e ferro o soltanto ferro. Le nitrogenasi alternative non vengono sintetizzate quando nell'ambiente è presente sufficiente molibdeno; la nitrogenasi contenente molibdeno è, infatti, la nitrogenasi principale degli organismi azotofissatori. Presumibilmente le nitrogenasi alternative servono come meccanismo di riserva per assicurare la possibilità di fissare l'azoto anche quando la concentrazione di molibdeno nell'habitat è limitante.

Data la stabilità del triplo legarne NºN, l'azoto molecolare è molto inerte e la sua attivazione è un processo energeticamente molto costoso. Per ridurre N₂ a 2NH₃ devono essere trasferiti sei elettroni; anche se per questo processo è possibile ipotizzare la formazione di diversi intermedi nessuno di essi è mai stato isolato, facendo pensare che i tre passaggi successivi necessari per la riduzione avvengano mantenendo tutti gli intermedi strettamente legati alla nitrogenasi. La fissazione dell'azoto è un processo altamente riduttivo e viene inibito dall'ossigeno la cui presenza provoca l'inattivazione rapida e irreversibile della dinitrogenasi reduttasi (persino di quelle isolate da batteri aerobi). Nei batteri aerobi la fissazione dell'azoto può avvenire nelle cellule integre, ma non in estratti enzimatici purificati; nelle cellule integre dei batteri aerobi infatti la nitrogenasi è protetta dall'inattivazione da ossigeno o rimuovendo l'ossigeno mediante la respirazione, o producendo materiale mucillaginoso che sfavorisce la penetrazione dell'ossigeno, o compartimentalizzando la nitrogenasi in cellule specializzate differenziate a questo scopo (p.c. le eterocisti).

Flusso di elettroni nella fissazione dell'azoto

Il flusso di elettroni nella fissazione dell'azoto può essere così schematizzato:

donatore di elettroni--->dinitrogenasi reduttasi --> dinitrogenasi->N₂ --> 2NH₃.

Gli elettroni necessari per la riduzione dell'azoto sono trasferiti alla dinitrogenasi reduttasi da una ferredossina o da una flavodossina, proteine ferro‑zolfo a basso potenziale di ossidoriduzione. In Clostridium pasteurianum, il donatore di elettroni è la ferredossina che viene ridotta mediante scissione fosforoclastica del piruvato a dare acetil-CoA + CO₂. Per la fissazione dell'azoto è necessario, oltre alla ferredossina ridotta, ATP. La richiesta di ATP per questo processo è molto alta; vengono infatti idrolizzati da 4 a 5 ATP ogni 2e^‑ trasferiti. L'ATP e` necessario per ridurre il potenziale di ossidoriduzione della nitrogenasi fino a un livello sufficiente per ridurre l`azoto. I1 potenziale di ossidoriduzione della dinitrogenasi reduttasi e` di -0,30 volt, e viene ridotto fino a -0,40 volt quando gli elettroni vengono trasferiti all'enzima e viene idrolizzato I'ATP. A questo punto il complesso si combina con la dinitrogenasi riducendola. La dinitrogenasi ridotta, a sua volta riduce N<sub>2</sub> a 2NH<sub>3</sub>; tale riduzione avviene al centro FeMoCo. Nonostante siano necessari solo sei elettroni per ridurre I'azoto molecolare, misurazioni accurate hanno dimostrato che nel processo vengono, invece, consumati otto elettroni, due dei quali vengono di fatto persi con la formazione di una mole di H<sub>2</sub> per mole di N<sub>2</sub> ridotto. La ragione di questo apparente spreco non e` nota, ma ci sono forti evidenze a favore del fatto che la produzione di H₂ sia insita nel meccanismo di reazione della nitrogenasi.

Genetica e regolazione della fissazione dell'azoto

In Klebsiella pneumoniae, un batterio azotofissatore molto studiato, i geni per la dinitrogenasi e la dinitrogenasi reduttasi fanno parte di un complesso regulone (un insieme di operoni correlati) chiamato regulone nif. Nel regulone nif ci sono, oltre ai geni strutturali per il complesso della nitrogenasi, anche i geni per il FeMoCo, i geni che controllano le proteine implicate nel trasporto di elettroni, e diversi geni regolatori. La dinitrogenasi e` composta da quattro subunita` due subunita` alfa (prodotto del gene nifD) e due subunita` beta (prodotto del gene nifk). La dinitrogenasi reduttasi e` un dimero di due subunita` identiche, prodotto del gene nifH. Alla sintesi del FeMoCo partecipano cinque geni, nifN, E, W, B e Q, e quest'ultimo codifica per un prodotto coinvolto nell'assimilazione del molibdeno. NifA codifica per un regolatore positivo necessario per attivare la trascrizione degli altri geni nif.

La nitrogenasi è sottoposta a una regolazione molto rigorosa. La fissazione dell'azoto è inibita da 0₂ e dalla presenza di azoto combinato, NH₃, N0₃ e alcuni aminoacidi. La regolazione avviene soprattutto a livello della trascrizione. La trascrizione dei geni nif strutturali e` attivata dalla proteina NifA (regolazione positiva) e repressa dalla proteina NifL, (regolazione negativa); i dettagli del meccanismo con cui queste proteine regolano la trascrizione cominciano ad essere noti solo adesso.

Naturalmente, l'ammoniaca prodotta dalla nitrogenasi non reprime la sintesi dell'enzima perche` non appena essa viene prodotta, viene immediatamente utilizzata per le biosintesi e incorporata in composti organici. Invece, quando l`ammoniaca e` in eccesso (ambienti con concentrazioni elevate di ammoniaca), la sintesi della nitrogenasi viene rapidamente repressa. La repressione della sintesi dell'enzima impedisce che venga sprecato ATP per produrre un composto gia` disponibile. In alcuni batteri azotofissatori, specialmente nei batteri fototrofi, anche l'attività della nitrogenasi è regolata dall'ammoniaca. In questo caso, l'eccesso di ammoniaca provoca una modificazione covalente della dinitrogenasi reduttasi che causa la perdita di attivita` dell'enzima. Quando I'ammoniaca diventa nuovamente limitante, la proteina e` riconvertita alla forma attiva e la fissazione dell'azoto riprende. L`ammoniaca esercita quindi un controllo rapido e reversibile sul consumo di ATP da parte della nitrogenasi.

La nitrogenasi e` stata purificata da diversi microrganismi azotofissatori e in tutti i casi e` stato dimostrato che si tratta di un complesso di due proteine. Dal punto di vista evolutivo e` notevolmente interessante il fatto che, tra le nitrogenasi che contengono molibdeno, la nitrogenasi purificata da un dato organismo e` di solito in grado di funzionare con la dinitrogenasi reduttasi isolata da un organismo diverso. Ciò puo` significare che la struttura dei componenti della nitrogenasi non sono cambiati significativamente durante l'evoluzione e suggerisce anche che le richieste molecolari per la riduzione dell'azoto gassoso sono piuttosto specifiche. Di fatto, studi sui geni nifH,D,K hanno dimostrato che sonde che contengono questi geni, clonati da un organismo azotofissatore, virtualmente ibridano con il DNA di tutti gli organismi azotofissatori, mentre non ibridano con il DNA di altri batteri.

Saggio della nitrogenasi

La nitrogenasi non e` strettamente specifica per I'azoto molecolare ma e` capace di ridurre anche diversi composti contenenti un triplo legame come il cianuro (CN^‑) e I'acetilene (HCºCH). La riduzione dell'acetilene da parte della nitrogenasi e` un processo in cui viene prodotto etilene (H<sub>2</sub>C=CH<sub>2</sub>) con il trasferimento di due soli elettroni. Probabilmente la riduzione dell'acetilene non ha nessun significato biologico, ma risulta invece molto utile al ricercatore dato che e` piuttosto semplice misurare, mediante gas‑cromatografia, la riduzione dell'acetilene a etilene. Questa tecnica e` molto utilizzata per rilevare processi di azotofissazione in sistemi ignoti. Prima che la tecnica venisse messa a punto, era molto difficile dimostrare che un organismo fosse capace di fissare l'azoto e molti casi di presunti organismi azotofissatori si sono dimostrati errori di valutazione. Infatti, la crescita di un organismo in un terreno privo di azoto fissato non significa necessariamente che l'organismo possa fissare l'azoto molecolare, dato che nel terreno possono essere presenti, come contaminanti, tracce di azoto fissato, che possono provenire dagli ingredienti utilizzati per la preparazione del terreno o in seguito alla contaminazione del terreno stesso con particelle di polvere o con composti gassosi dell'azoto.

Una procedura conclusiva per provare se in un sistema ha luogo la fissazione dell'azoto prevede l'uso di un isotopo dell'azoto, ¹⁵N, come tracciante. (¹⁵N non è un radioisotopo ma un isotopo stabile e viene rilevato mediante spettrometria di massa). La fase gassosa di una coltura viene arricchita con ¹⁵N e, dopo incubazione, le cellule e il terreno colturale vengono digeriti, l'ammoniaca prodotta viene distillata e ne viene esaminato il contenuto di ¹⁵N. La produzione di quantità significative di ammoniaca marcata con ¹⁵N costituisce una prova dell'avvenuta fissazione dell'azoto. Comunque, il metodo più sensibile per stabilire se in un campione avviene la fissazione dell'azoto consiste nel misurare l'etilene prodotto a partire dall'acetilene. Il campione, che può essere suolo, acqua, una coltura o un estratto cellulare, viene incubato in presenza di acetilene e la miscela di reazione viene quindi sottoposta a gas‑cromatografia per verificare se vi è stata produzione di etilene. Tra tutti i metodi sviluppati per determinare la fissazione dell'azoto questo è il più semplice e veloce.