Purificazione di una proteina

natura del problema: purificare una proteina che può essere presente anche in minima parte (~0.001%) da una miscela grezza contenente molte altre proteine, acidi nucleici, polisaccaridi, lipidi e molecole più piccole (zuccheri, peptidi, aminoacidi, ormoni, etc.) Questo deve essere fatto con ragionevole efficienza.

A seconda  degli scopi la purificazione può essere di tipo analitico o preparativo.

Le proprietà delle proteine che vengono sfruttate per ottenere lo scopo sono:

• la dimensione e forma

• il contenuto in aminoacidi acido o basici (la carica di una proteina è la somma delle cariche (+) e (-) ad un dato pH sulla superficie.

• il punto isoelettrico

• la distribuzione di carica (ci può essere una distribuzione non uniforme sulla superficie)

• solubilità (influenzata da pH, forza ionica)

• densità (~1.4 g/cm³) lipoproteine<proteine<fosfoproteine

• idrofobicità (numero e distribuzione dei residui idrofobici)

• capacità a legare metalli o altre molecole

• capacità di associazione e dissociazione (reversibili)

• specificità di sequenza o di struttura (anticorpi)

• presenza di modifiche post-traduzionali

• altre proprietà (es. termolabilità)

Norme generali

1. Avere a disposizione un metodo per seguire l'attività biologica della proteina d'interesse, cioè un saggio specifico, che deve basare su caratteristiche uniche della proteina di interesse
   • un'attività enzimatica
   • un' attività immunologica
   • caratteristiche fisiche (es. massa molecolare, proprietà spettroscopiche,etc.)
   • un'attività biologica

   idealmente un saggio dovrebbe essere:

   • specifico (non si vuole un falso positivo)

   • rapido (non vogliamo aspettare giorni per un risultato)

   • sensibile (non vogliamo consumare tutto il nostro campione solo per saggiarlo)

   • quantitativo (ci serve un metodo accurato per misurare la quantità di proteina ad ogni passaggio della purificazione)

2. Scegliere, se possibile, una fonte molto ricca del prodotto desiderato
3. Cercare di usare il minor numero possibile di passaggi di purificazione
4. Prendere le necessarie precauzioni durante la purificazione  per minimizzare i danni (inattivazione irreversibile e perdita della proteina-> temperatura, agenti stabilizzanti, eliminazione di proteasi, ....detergenti per proteine di membrana)

Criteri di purezza di una proteina

Non esiste un test definitivo per affermare che una proteina è pura, infatti una preparazione che risulti pura con una certa metodica può rivelarsi contaminata usando una tecnica di rivelazione molto più risolutiva.

Il miglior criterio è quello di impiegare diverse tecniche per effettuare "tests" basati su differenti caratteristiche della molecola in esame.

Alcune regole:

1. una preparazione omogenea deve mostrare costanza dell'attività specifica anche quando sottoposta ad ulteriori passaggi di purificazione.

2. L'elettroforesi in condizioni native deve mostrare una sola banda (anche se il campione è sovraccaricato) sia se condotta a pH acido che a pH alcalino.

3. l'elettroforesi in condizioni dissocianti riducenti non deve fornire risultati coerenti.

4. Un'unica banda deve essere osservata anche usando l'elettrofocusing.

5. La determinazione del residuo N-terminale della proteina deve fornire come risultato un singolo residuo amminoacidico.

La purificazione di una proteina può essere pensata come una serie di frazionamenti realizzati in modo tale che:

• la proteina di interesse si trovi quasi esclusivamente in una frazione (e con buona resa)

• un quantitativo significativo dei contaminanti si trovi in una frazione differente

Durante la purificazione ci sarà bisogno di monitorare alcuni parametri, che includono:

• Il volume totale del campione

• il quantitativo di proteine totali nel campione (può essere stimato ad esempio tramite A₂₈₀; 1.4~1.0 mg/ml, vedi determinazione della conc. proteica)

• le unità di attività della proteina desiderata (ricavate da un saggio specifico)

Queste informazioni di base ci permetteranno di tenere traccia delle seguenti informazioni durante ogni passaggio della purificazione:

• la resa

• l'attività specifica (definita come l'unità di enzima per milligrammo di proteine totali U.I./mg , vedi corso di Enzimologia ® l'attività enzimatica)

• l'aumento di purificazione (es. 3,5X)

Nella costruzione di uno schema di purificazione tipicamente bisogna bilanciare purificazione con resa.

Ad esempio potrebbe essere semplice raggiungere il 90% della nostra proteina pura con una buona resa.

Tuttavia potrebbe rivelarsi difficile migliorare questa purezza di pochi percentili sempre mantenendo una buona resa.

Sarà l'utilizzo che verrà fatto della proteina a determinare il suo target di purezza finale.

Se la proteina deve essere utilizzata per ottenere informazioni sulla sequenza amminoacidica, il 90% è accettabile. Se invece deve essere utilizzata per scopi clinici il target di purezza può essere anche il 99,99%.

Fatte queste premesse generali, vediamo i 5 punti base della purificazione:

1. sviluppo della procedura di saggio

2. selezione della fonte migliore dalla quale la molecola può essere purificata

3. solubilizzazione della molecola desiderata (tutte le procedure di isolamento comunemente usate operano in soluzioni acquose)

4. stabilizzazione della molecola ripetutamente, ad ogni passaggio di purificazione

5. sviluppo di una serie di procedure di isolamento e concentrazione.

Esempio di purificazione di una proteina