Come produrre in grande quantità una proteina scarsamente
presente nella sua fonte (organismo o cellula) originale
- Purificare la proteina in tracce dalla sua
fonte originale. Usare tecniche analitiche e moto risolutive (p.es. HPLC)
- Sequenziare con i moderni sequenziatori la
proteina ottenuta (N-terminale)
- Tradurre la sequenza amminoacidica nella
corrispondente sequenza del DNA
- Sintetizzare un "probe" (una sonda) di DNA
di tale sequenza di lunghezza 14-20 basi.
- Costruire una "library" (libreria) genomica:
- frammentare il DNA delle cellule che
producono la proteina con enzimi di restrizione
- inserire in plasmidi ospiti i frammenti
- crescere varie colonie contenenti ciascuna
plasmidi diversi
- usare "il probe" per riconoscere (ibridizzazione)
il ceppo contenente il gene
- selezionare e far crescere tale ceppo che
produce la proteina in grande quantità
-
purificare la proteina