Determinazione della posizione dei ponti disolfuro
Con elettroforesi diagonale
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si
idrolizza la proteina nativa in frammenti. Si produrranno sia frammenti "lineari"
sia "cluster", ossia due o più peptidi tenuti insieme da ponti
disolfuro. Esempio:
Se abbiamo usato un enzima che taglia ad
esempio nei siti in posizione 10,20,110,120 oltre ai pezzi lineari
.....10,20....,....110,120.......
avremo un duplice peptide (con 2N-terminali)
11-20 + 110-120 , tenuto insieme da ponti disolfuro.
E' ovvio che per determinare la posizione dei
ponti disolfuro occorre conoscere la sequenza della proteina. (bisogna cioè
sapere che in posizione 15 e 112 ci sono residui di Cys. Dobbiamo ricordare
che la sequenza è fatta su frammenti di proteina ridotta ed alchilata.
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Elettroforesi della miscela di peptidi nativi in
una dimensione
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Elettroforesi della miscela di peptidi dopo
ossidazione con acido performico che ossida (spezzando) i disolfuro ad acido
cisteico. Questa elettroforesi è condotta in direzione perpendicolare alla
prima
i
peptidi lineari avranno la stessa mobilità e formeranno una diagonale.
i
peptidi che non seguono la diagonale sono quelli della seconda elettroforesi
formatisi grazie alla scissione dei ponti.
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si
isolano e si sequenziano i peptidi ossidati
Mediante analisi di
aminoacidi e/o sequenza
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si
idrolizza la proteina nativa in frammenti
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si
separano i frammenti (HPLC)
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si
effettua un analisi aminoacidica su tutti i frammenti separati. Questo
consente di individuare quelli che contengono Cys; dalla loro
composizione, conoscendo la
sequenza, si può già arrivare a capire la disposizione dei ponti
disolfuro.
se questo è un frammento isolato dal digerito la
sua composizione sarà Ala (1) Leu(2) Glu (1) Val (1) Pro(2) Cys(2) Met(1) Lys(1)
Arg(1) che giustifica un ponte 13-113
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se l'informazione non è immediatamente chiara si
sequenzierà il frammento ottenendo per ogni passo di Edman 2 residui a.acidici
e determinando la doppia sequenza riportata sopra. Da notare che sequenziando
un frammento di questo tipo con le Cys non ridotte e piridiletilate al passo
corrispondente ad esse non si identificherà nessun residuo (distruzione).
Con
la spettrometria di massa
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Si frammenta la proteina nativa con metodi
enzimatici e/o chimici
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Una parte del campione frammentato viene
ridotta
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si paragonano gli spettri delle due miscele; lo
spettro della miscela "nativa" conterrà dei segnali che saranno invece assenti
nello spettro della miscela "ridotta"; identificazione di questi segnali come
appartenenti a dei "cluster" contenenti peptidi uniti fra di loro da uno o più
ponti disolfuro, lungo la sequenza nota.
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Conferma delle assegnazioni fatte, effettuando
uno o più passi di
Edman
sulla miscela "nativa" ed analizzando gli spettri risultanti.
Qualunque sia il
metodo che porti all'identificazione di un frammento contenente ponti disolfuro
(elettroforesi diagonale, analisi di a.acidi, sequenza o spettri di massa
FAB, o anche questi metodi
combinati tra loro) si osservi che la
determinazione univoca la si può avere soltanto se il frammento contiene un sol
ponte disolfuro. Se infatti il frammento contiene già 2 ponti disolfuro,
si hanno le possibilità
se usiamo l'approccio dell'elettroforesi diagonale
alla fine avremo i 2 frammenti separati ma nulla sulla esatta dislocazione dei
ponti. Se usiamo l'approccio dell'analisi di a.acidi e/o sequenza determineremo
in ambedue i casi la stessa doppia sequenza.
In questi casi il frammento viene sub-digerito con
metodi chimici o enzimatici diversi da quello usato per la frammentazione, in
modo da ottenere più "sottoframmenti", ciascuno contenente un sol ponte
disolfuro.