pH e  tamponi

• Nei sistemi biologici vi è un pH praticamente costante, regolato da efficaci sistemi tampone in grado di compensare le variazioni di pH dovute alla produzione metabolica di acidi come l'acido lattico o di basi come l'ammoniaca.

• i sistemi tampone più importanti nei fluidi cellulari sono il fosfato, il bicarbonato, gli amminoacidi e le proteine.

• le attività biologiche sono sensibili al pH per varie ragioni:

  • una reazione può essere caratterizzata da ioni idrogeno o gli ioni stessi possono essere reagenti o prodotti della reazione stessa.

  • oppure una variazione di pH può portare alla variazione della distribuzione di una sostanza o di uno ione attraverso una membrana modificando la permeabilità della membrana stessa. Le membrane infatti, come molte altre strutture e molecole biologiche, posseggono gruppi ionizzabili il cui stato di ionizzazione ha effetto sulla struttura molecolare e quindi sull'attività biologica. Questo vale particolarmente per gli enzimi, per le proteine.

    Alcune proteine per espletare la propria funzione biologica hanno bisogno di una piccola variazione di pH dell'ambiente              ®

    Es. l'emoglobina porta ossigeno dai polmoni ai tessuti e la diminuzione di pH ai tessuti dovuta alla produzione degli stessi di CO2 e ioni idrogeno facilita il rilascio di ossigeno. Nel rilascio di O2 l'Hb acquisisce protoni svolgendo così un'azione tampone sul sistema.

• i tamponi vengono utilizzati nello studio delle attività metaboliche e possono anche essere "non fisiologici".

• variazioni deliberate di pH possono essere utilmente impiegate nello studio analitico di alcune molecole (aminoacidi, proteine, acidi nucleici) quando si usano tecniche quali elettroforesi e la cromatografia a scambio ionico).

Cos'è un tampone

E' una soluzione capace di limitare la variazione del pH. Di conseguenza trova largo impiego in tutti quei casi in cui è necessario operare in un mezzo ad acidità (o basicità costante).

- cosa contiene la soluzione?

1. un tampone acido contiene un acido debole ed il suo sale di una base forte

2. un tampone basico contiene una base debole ed il suo sale di un'acido forte

1. un esempio è la soluzione acido acetico - acetato di sodio.

   • se aggiungiamo una base, gli ioni OH^- si combineranno con gli ioni H⁺ derivanti dalla ionizzazione dell'acido. Gli ioni H⁺ continuamente sottratti dagli ioni OH^- vengono riforniti dall'acido e il PH non cambia.

   • se aggiungiamo un acido, gli ioni H⁺ si legheranno all'acetato per formare l'acido debole acido acetico. Questo equilibrio infatti   è fortemente spostato verso destra (le frecce sono errate, indicano un equilibrio).

2. un esempio è la soluzione NH₃-ClNH₄⁺

   • se aggiungiamo una base gli ioni OH^- si legheranno con gli ioni H⁺ provenienti dall'ammonio, a sua volta proveniente dalla dissociazione del sale.

   • se aggiungiamo un acido gli ioni H⁺ reagiranno con l'ammoniaca a formare lo ione ammonio, un acido debole. Questo equilibrio infatti è spostato a destra (le frecce sono errate, indicano un equilibrio).

Per un tampone acido si può sapere il pH della soluzione conoscendo il valore della costante di ionizzazione dell'acido debole, K_q e le concentrazioni dell'acido e del sale.

si può mostrare che una soluzione tampone ha la massima efficienza (massimo "potere tampone" quando il pH della soluzione è vicino al valore di pK_a, cosa che si verifica quando C_s non è troppo diverso da C_HA (o C_B).

Per assicurare la costanza del pH intorno ad un determinato valore, è necessario quindi servirsi di soluzioni tampone appropriate, contenenti acido (o basi) deboli aventi pK_a ) o 14-pK_B) prossimi al valore desiderato del pH.

L'entità dell'azione tampone è chiamata capacità tampone ( β ) ed è definita come la quantità di base forte necessaria per far variare il pH di una unità.

Le caratteristiche del tampone per la sperimentazione biologica:

1. Buona capacità tampone per l'intervallo richiesto

2. solubile e non permeabile alle membrane

3. pH poco sensibile al medium

4. non tossico, no inibitore

5. no complessi con cationi

6. no assorbimento alla luce visibile e ultravioletta

Anfoliti in soluzione acquosa

Sono sostanze capaci di reagire sia come acidi che come basi.

In soluzione acquosa un anfolita può esistere naturalmente sia nella forma indissociata, che come catione, che come anione a seconda del pH della soluzione e del valore delle costanti K_a e K_b.

Va inoltre considerata una quarta forma, che ha notevole importanza nel caso di anfoliti organici come gli aminoacidi.

Ad esempio la glicina può esistere in soluzione oltre che come forma non ionizzata, come catione ed anione anche come ione dipolare o sale interno, cioè in una forma ionizzata anche se nel complesso neutra.

Si definisce punto isoelettrico di un anfolita HA quel valore del pH al quale la concentrazione del catione e dell'anione sono uguali   

[H₂A⁺]=[A^-]

Il punto isoelettrico pH^* si può calcolare uguagliando le concentrazioni dell'anione e del catione quali risultano dalle costanti di equilibrio.

=> pH^*=1/2 (pK_W+pK_a-pK_b)=7+ [(pK_a-K_b)/2]

Gli aminoacidi, anfoliti organici

Gli a-aminoacidi sono tutti degli elettroliti deboli e, a aprte la prolina, hanno una formula generale RCH (NH₂)COOH.

Avendo quindi sia un gruppo carbossilico sia un gruppo aminico, sono ionizzati a tutti i valori di pH. Ciò significa che la specie neutra rappresentata dalla formula di tipo generale non può esistere in soluzione, qualsiasi sia il pH.

­

il pH al quale la molecola è presente come ione dipolare prende il nome di punto isoionico.

¯

Per gli a.a. corrisponde al punto isoelettrico perché essi non presentano carica netta e quindi non hanno mobilità elettroforetica.

il valore di questo pH dipende dalla forza dell'acido secondo l'equazione

pH^*= (pK_a1+pK_a2)/2

Per a.a. che hanno anche il gruppo R ionizzabile gli equilibri possibili aumentano. Tali gruppi sono ad esempio il gruppo fenolico (tirosina), il gruppo sulfidrilico (cisteina), il gruppo guanidico (arginina), il gruppo imidazolico (istidina).

Per la separazione elettroforetica o con cromatografia a scambio ionico di miscele di a.a quali quelli presenti in un idrolisato proteico, si sfruttano appunto queste differenze.

Generalmente, il punto isoionico e il punto isoelettrico di una proteina a differenza di quelli di un a.a. non coincidono.

Per la determinazione del pI la proteina deve essere in una soluzione tampone che contiene anioni e cationi a basso peso molecolare, capaci di legarsi alla proteina multionizzata.

E' il pH, tra l'altro, al quale la proteina ha una minor solubilità, poiché a questo punto non si ha repulsione elettrostatica tra le molecole proteiche vicine; esse tendono a unirsi e precipitare.

Si può ottenere aggregazione e conseguente precipitazione delle proteine mediante l'aggiunta di sali come il solfato d'ammonio alla soluzione proteica.

A una concentrazione caratteristica del sale, le interazioni proteina-proteina diventano predominanti sulle interazioni proteina-acqua e hanno luogo l'aggregazione e la precipitazione.

Anche per la separazione di proteine diverse con tecniche elettroforetiche e di cromatografia a scambio ionico si sfruttano differenze di punto isoelettrico.

Le costanti di ionizzazione sono evidenziabili tramite una curva di titolazione.

NOTA: La titolazione è una operazione analitica in cui la soluzione di un reattivo a concentrazione "titolo" nota è aggiunta alla soluzione di un reattivo la cui concentrazione è sconosciuta o da determinare.

Esempio per l'acido acetico:

1) La regione tamponante è compresa nell'intervallo pK_a±1

2) maggiore è la concentrazione totale, maggiore è la capacità tampone.