La spettroscopia di massa grazie al progresso tecnologico è diventata ormai essenziale per risolvere i problemi che si incontrano nella odierna ricerca di proteine e acidi nucleici.
E' possibile infatti determinare masse molecolari di grandi macromolecole con un accuratezza di ±1 unità di massa. Questo mi consente di
osservare modificazioni post-traduzionali delle proteine,
confermare effetti di mutagenesi,
sequenziare proteine omologhe (o nuove con l'ausilio di software opportuni),
studiare interazioni macromolecola-macromolecola (cinetica di enzimi idrolitici su substrati peptidici)
localizzare ponti disolfuro
fare un controllo di qualità di peptidi sintetici
e molto altro - tutto questo usando campioni piccoli e qualche volta anche impuri.
L'utilizzo della spettrometria di massa per investigare processi biologici risale a fine anni '30, primi anni '40. Dai primi anni '80 è cominciato il drastico cambiamento nell'utilizzo di questo tipo di spettroscopia per fini biologici. La ragione di questo cambiamento è stata l'introduzione di nuove tecniche di ionizzazione come il FAB (fast atom bombardment, bombardamento con atomi veloci), il PD (plasma desorption, desorbimento mediante plasma) e il TSP (thermospray) che hanno permesso la produzione di ioni in fase gassosa da composti polari e carichi senza preventiva derivatizzazione chimica.
Nell'ultimo decennio altre tecniche di ionizzazione come l'ES (elettrospray) e il MALDI (matrix assisted laser desorption ionization) hanno incrementato ancora di più l'uso della spettroscopia di massa in biologia. Oggi possono essere misurate sostanze presenti in concentrazione di 10-11M e le masse molecolari delle proteine oltre i 100,000 Da possono essere ottenute con una accuratezza fino a mille volte più grande che facendo uso di un gel elettroforetico.
Uno spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni e li separa in fase gassosa in accordo al loro rapporto massa/carica (m/z). Oggi è disponibile un ampia varietà di spettrofotometri di massa, dai detectors per la gas cromatografia agli spettrometri acceleratori di massa. Tutti condividono la capacità di assegnare valori massa/carica agli ioni, sebbene i principi di questa operazione e i tipi di esperimenti che possono essere fatti possano differire grandemente.
Un analisi allo spettrometro di massa è fatta di
I campioni possono essere introdotti negli stati solido , liquido e gassoso. Nel caso fossero solidi o liquidi devono essere resi volatili prima o durante la ionizzazione. Sono molte le tecniche di ionizzazione che producono molecole cariche in fase gassosa, e vanno dalle semplici EI (ionizzazione a impatto elettronico) e CI (ionizzazione chimica) a varie tecniche di ionizzazione con desorbimento (FAB, PD, ES, e MALD).
Gli spettrometri di massa sono fatti per operare a basse pressioni in modo da prevenire la collisione degli ioni con le molecole del gas residuo nell'analizzatore.
Una volta che si sono formati gli ioni essi possono essere accelerati, focalizzati o fatti risuonare tramite campi elettrici e magnetici.
Descriviamo 4 tra le esistenti tecniche di ionizzazione:
A impatto elettronico (EI)
Sostanze volatili possono essere ionizzate in un processo di interazione tra il campione gassoso con un fascio elettronico generato da un filamento di metallo riscaldato. Un campo magnetico mantiene il fascio elettronico focalizzato attraverso la fonte ionica fino alla "trappola". Dopo l'impatto con elettroni a 70eV, la molecola gassosa può perdere uno dei suoi elettroni e diventare un radicale ionico caricato positivamente. M + e- -> M+.+ 2e- dove M+. è lo ione molecolare. Porta un elettrone spaiato e può occupare vari stati elettronici e vibrazionali eccitati. Se questi stati eccitati contengono abbastanza energia, i legami si romperanno e si formeranno frammenti ionici e particelle neutre. Con 70eV c'è abbastanza energia per causare una vasta frammentazione.
Tutti gli ioni vengono quindi accelerati da un campo elettrico prodotto con una differenza di potenziale applicata tra al fonte ionica e un elettrodo "a terra". Un "repeller" serve a definire il campo che comprende la fonte ionica.
A seconda del tempo di vita dello stato eccitato, la frammentazione avverrà o nella fonte ionica dando origine a frammenti ionici stabili, oppure sulla via del detector, producendo ioni metastabili. Se non avviene alcuna frammentazione prima che gli ioni raggiungono il detector allora verrà generato un segnale per lo ione molecolare.
Lo spettro di massa ottenuto dall'analisi di tutti gli ioni contiene segnali diversi rapporti m/z e intensità, dipendenti dal numero di ioni che raggiungono il detector.
Il tipo di frammentazione dello ione molecolare dipende dalla struttura della molecola e strutture simili danno spettri di massa simili.
Al giorno d'oggi ci sono archivi di spettri di massa che contengono oltre 160.000 spettri che possono essere utilizzati per aiutare a identificare sostanze ignote e cercare sottostrutture comuni.
A ionizzazione chimica (CI)
Si basa sull'interazione della molecola di interesse con specie reagenti ionizzate. Molti reagenti reattivi sono acidi di Brönsted gassosi. Ad esempio, una delle specie reagenti più utilizzate sono generate per IE dal metano. Il primo ione che si forma è il CH4+. che reagisce a dare l'acido di Brönsted CH5+ secondo questa reazione
CH4+. + CH4 -> CH5+ + CH3.
Se una molecola M neutra nella fonte ha una affinità più alta per i protoni del metano si formerà la specie MH+ in una reazione esotermica
CH5+ + M -> CH4 + MH+
La strumentazione per la CI è molto simile a quella usata per l'EI. La differenza maggiore riguarda il mantenimento all'interno dello spettrometro di una pressione più alta per favorire le reazioni ione molecola.
A bombardamento con atomi veloci (FAB)
è un'altra tecnica di ionizzazione soft, cioè che porta ad una frammentazione minima. Va bene per composti polari e termolabili.
In una tipica analisi FAB, il campione viene usualmente disciolto su una appropriata matrice, un solvente viscoso, in modo da mantenere il campione in uno stato liquido.
Tra le più comuni matrici liquide ci sono il glicerolo, il 1-tioglicerolo, una miscela di ditiotreitolo e ditioeritrolo, alcol 3-nitrobenzile e trietanolammina.
Uno tra i ruoli più importanti della matrice, grazie al suo punto di congelamento basso, è quello di mantenere il campione allo stato liquido. La matrice ha anche il ruolo di ridurre danni all'analita causati dal bombardamento di particelle ad alta energia.
La ionizzazione viene effettuata bombardando la soluzione liquida dell'analita con atomi veoci di Ar o Xe con un energia cinetica di 8-10 keV o ioni veloci (Cs+ fino a 35 keV). Questa ultima versione è nota come liquid secondary ion mass spectrometry (LSIMS or liquidSIMS).
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bombardamento della matrice |
schema di un FAB-MS |
Il maggior vantaggio del FAB è la facilità di utilizzo , così come la interpretazione degli spettri.
Tra gli svantaggi, cluster ionici provenienti dalla matrice possono dominare lo spettro. Inoltre danni alla matrice causati dal bombardamento danno un intenso background chimico.
di campo (FI, field ionization)
il campione è allo stato di vapore e le molecole vengono sottoposte ad un intenso campo elettrico. Gli elettroni di legame più esterni sono sottoposti a forze con energia sufficiente a rimuovere un elettrone. Si forma così il radicale cationico che può essere analizzato.
per desorbimento mediante plasma (PD, plasma desorption)
il termine plasma è riferito a nuclei atomici privi di elettroni (normalmente Ba2+ e Tc18) provenienti dal decadimento del 252Cf (Californio). Il campione contenente le molecole da analizzare (anche di notevoli dimensioni come proteine) viene sottomesso al bombardamento del plasma che ne provoca la ionizzazione ed il passaggio dello ione molecolare nella fase gassosa (desorbimento).
per desorbimento mediante laser (LD, laser desorption)
la ionizzazione è provocata da raggi laser che conferiscono al campione anche l'energia necessaria per il desorbimento.
per desorbimento con laser assistito da matrice (MALD, matrix-assisted laser desorption)
Con questa tecnica si è in grado di rilevare biomolecole grandi oltre 300,000 dalton.
Si mette il campione a contatto con una matrice che assorbe energia alla lunghezza d'onda del laser. L'effettivo meccanismo del MALD ,una combinazione di desorbimento e ionizzazione, è tuttora oggetto di studio.
Con gli odierni strumenti commerciali si riesce a raggiungere in condizioni favorevoli un'accuratezza di massa di ±1 Da su una massa molecolare di 10,000.
Risulta una tecnica veloce e sensibile, implementata su strumenti piccoli e relativamente economici che non richiedono grande esperienza nella spettrometria di massa. Sono strumenti ideali per biologi che hanno bisogno di informazioni sulla massa molecolare più rapidamente e accuratamente di quanto non possano fare con un gel elettroforetico.
mediante termospray (TSI)
il principio consiste nella produzione di uno spray di goccioline liquide cariche che solvatano le specie da analizzare. Man mano che il solvente evapora nella sorgente ad alto vuoto, le dimensioni delle goccioline diminuiscono mentre permane la carica sulla molecola da studiare. Per produrre lo spray si usano effetti termici.
mediante elettrospray (ESI)
viene utilizzato un gas (di solito azoto) per produrre la nebulizzazione. Con questo tipo di tecnica sulla specie molecolare si può depositare una carica multipla. Siccome ogni misura di spettrometria di massa è una misura del rapporto m/z ne consegue che all'aumentare di z, il rapporto m/z diminuisce e quindi possono essere analizzate anche sostanze con una elevatissima massa molecolare. Al momento il maggiore impiego dell'ESI è per la determinazione accurata della massa molecolare. Infatti l'accuratezza è di parecchi ordini di grandezza superiori a qualsiasi altra tecnica analitica.