In un campo centrifugo le particelle possono essere separate poiché sedimentano con velocità diversa a seconda delle diverse caratteristiche di densità , dimensione e forma. Ogni particella sedimenta con una velocità che è proporzionale al campo centrifugo applicato.
I costituenti delle centrifughe:
Rotore con alloggiamenti
(immagine a destra)
Contenitori per i campioni (provette o bottiglie con pareti resistenti)
Asse centrale (motore per il movimento)
Controllo temperatura
Pompa da vuoto
La velocità di sedimentazione dipende dal campo centrifugo (G) applicato alla particella che è diretto radialmente verso l'esterno.
il campo centrifugo è funzione della velocità angolare del rotore (ω, in radianti sec-1) e della distanza radiale della particella dall'asse di rotazione (r in cm)
G=ω2r
Una rivoluzione del rotore è pari a 2p radianti, per cui ω (radianti al secondo) può essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto (riv.min-1) che è il modo più comune di esprimere la velocità del rotore.
ω = 2p/60 riv.min-1
quindi in termini di rivoluzioni/min
G=(4p2r/3600) r [(riv.min-1)2cm]
G è generalmente espresso in multipli del campo gravitazionale terrestre (g=980 cm S-2), cioè come rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della stessa particella in presenza della sola forza di gravità; con tale espressione G è definito come campo centrifugo relativo (RCF) o più comunemente come "numero di g" (quante volte la forza di gravità)
RCF = numero di g = (4p2r/3600x980) r [(riv.min-1)2cm]
abbreviando
RCF = (1.11 · 10-5) r [(riv.min-1)2cm]
La velocità di sedimentazione della particella oltre che dal campo centrifugo applicato dipende anche da:
densità e dimensione della particella
densità e viscosità del mezzo in cui avviene la sedimentazione
forma della particella (più o meno sferica)
Quando una particella sferica sedimenta deve spostare una parte del liquido in cui è sospesa, quindi essa riceve una spinta verso l'alto pari al peso di liquido spostato, incontrando una forza F pari a :
F= 4/3 p r3p (ρp- ρm) ω2r
dove
4/3 p r3p= volume della particella sferica di raggio rp
ρp = densità della particella
ρm= densità del mezzo
r = distanza della particella dal centro di rotazione
La forza F è quella applicata alla particella quando sedimenta. Tuttavia, quando le particelle migrano attraverso la soluzione generano attrito e la forza di attrito che si oppone al moto della particella è dato dalla legge di Stokes:
f0= 6 p h rp v
dove
f0= coefficiente d'attrito per le particele sferiche
h = coefficiente di viscosità del mezzo
v = velocità di sedimentazione della particella
Quindi una particella sarà accelerata nel campo centrifugo quando la forza applicata su di essa sarà uguale alla forza d'attrito, cioè:
F=f0 ,ossia:
4/3 p r3p (ρp- ρm) ω2r =6 p h rp v
dividendo ambo i membri per 6 p rp si ottiene
2/9 r2p (ρp- ρm) ω2r = hv
per cui ricavando v si ha che la sedimentazione della particella è:
v = dr/dt = [2/9 r2p (ρp- ρm) ω2r]/ h
=> La velocità di sedimentazione di una particella è direttamente proporzionale a:
r2p = dimensione della particella !! (quadrato) esalta piccole differenze nella dimensione
(ρp- ρm)= differenza tra la sua densità e quella del mezzo
ω2 = velocità angolare del rotore
r =distanza della particella dal centro di rotazione
ed inversamente proporzionale a
h = coefficiente di viscosità del mezzo
Il tempo di sedimentazione
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rt= distanza radiale dall'asse di rotazione del menisco del liquido |
| rb= distanza radiale dell'asse di rotazione dal fondo della provetta |
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¬1 |
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Per integrazione dalla prima equazione si ottiene il tempo di sedimentazione in secondi: |
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¬2 |
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1. separazione di particelle diverse per densità e dimensione usando come criterio il tempo necessario per la loro completa sedimentazione 2. oppure la sedimentazione che si ottiene dopo un certo tempo |
| Particelle sferoidali con
diversa densità e/o dimensione, si possono quindi separare per
centrifugazione 1. utilizzando la sedimentazione che si ottiene dopo un certo tempo (eq.1) 2. utilizzando il tempo necessario per la loro completa sedimentazione (eq.2) |
Ordine di separazione dei costituenti cellulari con le tecniche centrifugative:
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Per particelle con forma molto lontana dalla sfera e con elevati coefficienti di frizione f>f0(sferico) l'eq.1 diventa
Il coefficiente di sedimentazione
La velocità di sedimentazione può essere espressa in termini di velocità per unità di campo centrifugo applicato. In tal caso essa viene definita coefficiente di sedimentazione s.
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s dipende da numerosi parametri fisici (t, p, h) per cui si preferisce esprimerlo in termini corretti in riferimento alla massa d'acqua a 20oC
s20,ω=coefficiente di sedimentazione standard
Inoltre diminuisce all'aumentare della concentrazione quindi s20,ω
viene misurato a varie conc. e poi estrapolato a conc. 0
s020,ω
Le dimensioni di s sono quelli di un tempo (sec) 1 Svedberg = 10-13 sec
Valori dei coefficienti di sedimentazione per altre strutture:
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s |
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| enzimi, ormoni peptidici, proteine solubili | 2-25 s |
| Acidi nucleici | 3-100 s |
| Ribosomi e polisomi | 20-200 s |
| virus | 40-1.000 s |
| lisosomi | 4.000 s |
| membrane | 100-100x103 s |
| mitocondri | 20x103S-70x103 s |
| nuclei | 4.000x103 S-40.000x103 s |
La centrifugazione preparativa
Centrifugazione in gradiente di densità
Richiede
la presenza di una colonna di liquido la cui densità sia crescente man mano che
si raggiunge il fondo della provetta da centrifuga.
Il gradiente:
stabilizza la colonna di liquido all'interno della provetta
previene il rimescolamento per moti convettivi
migliora la risoluzione della separazione
permette la separazione della maggior parte o, talora, di tutti i componenti di una miscela.
I gradienti possono essere allestiti mediante due principali tipi di tecniche:
| la tecnica a gradiente discontinuo o "a gradino" | la tecnica a gradiente continuo |
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Nota: per una buona separazione di particelle di notevoli dimensioni come le subunità ribosomali, i poliribosomi e alcuni virus solitamente occorrono gradienti con forti differenze di densità e con un'alta colonna di liquido. |
Le tecniche di centrifugazione in gradiente di densità sono due:
la centrifugazione zonale di velocità e la centrifugazione isopicnica (di uguale densità)
entrambe vengono usate quando si richiede la separazione quantitativa di tutti i componenti di una miscela di particelle e inoltre per determinare la densità idrostatica (buoyant density) e i valori dei coefficienti di sedimentazione della particelle.
| centrifugazione zonale di velocità | centrifugazione isopicnica | |
Si stratifica il campione su un gradiente di densità in cui il valore di densità in ogni punto non deve superare quello delle particelle del campione. Si centrifuga fino a individuare delle bande di sedimentazione, ciascuna formata da particelle con una certa velocità di sedimentazione. La centrifugazione deve terminare prima che le bande si stratificano sul fondo!
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Si stratifica il campione su un gradiente di densità continuo che abbia un intervallo di densità tale da comprendere i valori di densità di tutte le particelle che si vogliono separare. Questa volta il valore massimo di densità del gradiente deve essere più alto di quello delle particelle più dense. E' una tecnica di equilibrio dove le particelle al termine della centrifugazione galleggeranno su un cuscinetto di liquido con densità superiore alla loro |
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Se non si vogliono separare tutti i componenti della miscela si sfrutterà la combinazione delle due tecniche. Le particelle da separare resteranno nella frazione isopicnica e le altre sedimenteranno sul fondo. |
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Il materiale sul quale viene condotto il frazionamento viene separato in un certo numero di frazioni mediante successive centrifugazioni, in cui aumenta di volta in volta il campo centrifugo applicato. A ogni passaggio si sceglie il campo centrifugo e il tempo di centrifugazione. Alla fine di ogni centrifugazione si separa il sedimento dal sovranatante e il sedimento viene "lavato" più volte, risospendendolo nel medium di omogeneizzazione e ricentrifugandolo nelle stesse condizioni.
Esempio di frazionamento di un omogenato di fegato di ratto nelle diverse frazioni subcellulari
Così facendo
si minimizza la contaminazione da particelle non desiderate
si migliora la separazione
si ottiene una preparazione quasi pura del materiale presente nel sedimento (quasi pura perché all'inizio della centrifugazione le particelle di diversa densità e dimensione sono distribuite in modo uniforme e il sedimento sarà una miscela di tutte le particelle, anche se in realtà quelle che sedimentano più rapidamente si troveranno in proporzione maggiore)
l'unico componente che può essere ottenuto puro con una sola centrifugazione anche se con resa limitata è il componente a più bassa velocità di sedimentazione, ovvero quello che rimane nel sovranatante.
Applicazioni dell'ultracentrifugazione analitica
1. Determinazione del peso molecolare: col metodo della velocità di sedimentazione e dell'equilibrio di sedimentazione.
La velocità di sedimentazione è calcolata come lo spostamento nel tempo del fronte fra il solvente puro ed il solvente in cui è presente il materiale che sedimenta per cui, calcolando v in questo modo, dall'equazione
si può conoscere s della sostanza e quindi estrapolando s020,ω il peso molecolare M è calcolato dall'equazione di Svedberg
dove R=costante dei gas (utilizzabile per soluzioni a dil.infinita T= temperatura Do20=coefficiente di diffusione della molecola =volume specifico parziale della molecola (aumento di volume che si ha per aggiunta di 1 g di soluto ad un volume molto grande di solvente)
ρ=densità del solvente a 20°C
I profili di sedimentazione sono ottenuti col sistema ottico di Schlieren che rileva a tempi diversi la variazione dell'indice di rifrazione nella cella in funzione della variazione di concentrazione del soluto. Il sistema può anche rivelare l'assorbimento nell'ultravioletto.
Nel rotore della ultracentrifuga analitica infatti prendono posto solo due celle, la cella analitica e quella di bilanciamento, che serve a controbilanciare quella analitica.
Nella cella di bilanciamento esistono due fori a distanza calibrata dall'asse di rotazione. Questi fori servono come riferimento per la misura delle distanze percorse dalle particelle nella cella analitica. Le celle analitiche devono avere anche i piani inferiore e superiore trasparenti in quarzo o zaffiro sintetico. Il sistema ottico Schlieren sfrutta il principio secondo cui la luce viene deviata quando passa attraverso una soluzione con zone a diversa densità e viene rifratta nel punto di demarcazione tra queste zone.
schema di una ultracentrifuga analitica
le celle
2. Criteri di purezza di macromolecole: si analizza il fronte di sedimentazione mediante il metodo della velocità di sedimentazione. Un singolo fronte di sedimentazione ben netto viene di solito considerato indice di omogeneità. Le impurità della preparazione vengono rilevate dalla presenza di altri picchi, di spalle sul picco principale o anche da asimmetrie del picco principale stesso.
3. Analisi conformazionale di macromolecole. Il DNA ad esempio può essere presente come filamento singolo o doppio, ciascuno dei quali può essere a sua volta circolare o lineare. Le variazioni conformazionali possono essere rilevate osservando le variazioni nella velocità di sedimentazione del campione. Nel caso di proteine allosteriche variazioni conformazionali sono anche associate al legarsi della proteina col substrato e/o con ligandi (attivatori/inibitori).
