L'isoelettrofocalizzazione (IEF)
Con questa tecnica composti anfoteri, come aminoacidi e peptidi, vengono separati in un campo elettrico lungo il quale viene stabilito un gradiente di potenziale e di pH.
Il gradiente di potenziale viene mantenuto stabile.
La regione anodica (+) sarà quella più acida e quella catodica (-) quella più basica.
Gli estremi di pH vengono scelti sulla base dei punti isoelettrici dei componenti da separare.
I composti che verranno caricati in una zona di pH inferiore al loro punto isoelettrico sono carichi positivamente e migrano verso il catodo fino a raggiungere il proprio punto isoelettrico.
Quelli che vengono caricati in una zona di pH superiore al proprio punto isoelettrico migreranno verso l'anodo fino a raggiungere il proprio pI.
dato che i singoli componenti si muovono comunque verso il proprio punto isoelettrico non ha alcuna importanza il punto di applicazione del campione.
è una tecnica dotata di un elevatissimo potere risolutivo ed è impiegata in particolare nella separazione di isoenzimi: è infatti sufficiente una differenza in punti isoelettrici di sole 0.01 unità di pH per ottenere una separazione apprezzabile.
il gradiente stabile di pH tra gli elettrodi viene realizzato con una miscela di anfoliti a basso peso molecolare aventi punti isoelettrici che coprono l'intervallo di pH desiderato. Gli anfoliti sono acidi alifatici sintetici poliamino-policarbossilici e sono in vendita in miscele che coprono o un ampio intervallo di pH (da 3 a 10) o un intervallo di pH ristretto (da 4 a 5). Nomi commerciali sono Ampholine (LBK), Bio-Lyte (Bio Rad) e Pharmalyte (Pharmacia).
La separazione può essere condotta o su colonna verticale o su lastra orizzontale di gel, utilizzando un apposita apparecchiatura.
Viene utilizzata a scopo preparativo.
Si riempie una colonna di vetro verticale con gel di poliacrilamide contenente anfoliti.
La parte superiore (anodo) viene collegata a un recipiente contenente una soluzione acida (ad esempio acido fosforico) mentre la parte inferiore (catodo) è collegata a un recipiente contenente una soluzione basica (ad esempio idrossido di sodio).
L'apertura di valvole di collegamento fa diffondere le soluzioni nella colonna, dando origine al gradiente di pH tra anodo e catodo alcalino.
Successivamente devono essere chiuse le valvole e si da corrente per provocare la migrazione degli anfoliti che raggiungeranno le zone di pH dove non hanno più carica netta (li rimarranno stazionari e stabilizzeranno il gradiente di pH).
Il campione viene fatto entrare con l'apertura di una valvola e dopo 1,5-3 ore la separazione è completa, la corrente viene tolta e tramite un collettore di frazioni si raccoglie il materiale separato.
Viene utilizzata a scopo analitico.
si usano sottili lastre di gel di 1-2 mm di spessore (a volte anche ultrasottili 0,15-0,25mm) che vengono montate su vetro o plastica.
il gel può essere di poliacrilamide o agarosio purificato nel caso di proteine ad alto peso molecolare (non presenta effetti di filtrazione molecolare).
la soluzione degli anfoliti viene mescolata ai monomeri prima che polimerizzino sulle piastre di supporto.
la fotopolimerizzazione del gel di poliacrilammide viene effettuata in presenza di riboflavina e non con persolfato d'ammonio che interferirebbe col processo di focalizzazione. Nota: le lastre di gel di poliacrilamide contenente anfoliti in vari intervalli di pH è possibile acquistarle già pronte.
il voltaggio usato deve essere molto alto ( fino a 2000 volt), impiegando degli alimentatori con potenza, voltaggio e corrente stabilizzati in grado di ridurre al minimo le fluttuazioni termiche.
sul lato anodico e su quello catodico della lastra vengono appoggiati ponti di carta da filtro imbevuta, rispettivamente, di acido e di alcali (ad esempio acido fosforico e idrossido di sodio).
Il contatto elettrico è invece assicurato da due fili di platino fissati al coperchio isolante e poggianti sui ponti.
il campione deve essere senza sali.
Applicazione del campione: pezzetti di carta da filtro vengono prima imbevuti con la soluzione diluita di campione (bastano pochi microgrammi di proteina), poi questi vengono poggiati sopra il gel.
Si procede quindi chiudendo il coperchio isolante, attivando il sistema di raffreddamento, e dando corrente per circa 30 minuti per far penetrare il campione del gel.
I pezzi di carta vengono rimossi e la corsa viene fatta riprendere per altre 1-2 ore.
Per determinare il punto isoelettrico dei componenti si usano standard a punto isoelettrico noto.
Rivelazione e identificazione
- Si sfrutta l'assorbimento e o la fluorescenza nell'ultravioletto. Ad esempio per gli acidi nucleici e le proteine in gel di poliacrilamide si sfrutta l'assorbimento a 260-280 nm.
- per un'analisi nel visibile si ricorre a una colorazione preventiva. L'eccesso di colorante deve essere rimosso. Prima di ogni colorazione però l'elettroforegramma deve essere fissato per ridurre la diffusione delle bande. (vale soprattutto per l'IEF). La soluzione di fissaggio può essere ad esempio acido tricloroacetico al 10% (per 30 minuti). Poi i campioni vengono colorati per 10 minuti col colorante appropriato (Blu Coomassie Brilliant R-250 per le proteine ad esempio). L'eccesso di colorante deve essere rimosso con ripetuti lavaggi in un decolorante (una soluzione acquosa di etanolo al 25% e acido acetico all'8%)
- la rivelazione degli enzimi avviene non fissando l'elettroforegramma e impiegando le tecniche di istochimica, in cui il substrato di un enzima si trasforma in un prodotto colorato insolubile. Il gel quindi viene fatto venire in contatto col substrato in condizioni tali che l'attività enzimatica sia ottimale.
- se invece il composto è radioattivo si procederà con l'autoradiografia.