La biochimica si occupa di comprendere e spiegare i principi unificanti e la diversità nella chimica degli organismi viventi mediante lo studio strutturale e funzionale delle molecole coinvolte.
L'indagine biochimica richiede frequentemente la purificazione di un particolare composto da una miscela complessa.
| Nelle separazioni analitiche l'obiettivo è l'identificazione e la stima di piccole quantità di una data sostanza e spesso non è necessario recuperare tale sostanza dopo la separazione. | Nelle separazioni preparative lo scopo principale è l'isolamento e il recupero in un alto grado di purezza di quantità più grandi possibili di una data sostanza per studiarne successivamente le proprietà chimiche e/o biologiche. |
La scelta delle tecniche di separazione e purificazione dipende dall'approccio analitico o preparativo adottato, principalmente perché quello preparativo richiede maggiori quantità di materiale di partenza e non necessariamente richiede l'uso di tecniche che forniscono un alto recupero percentuale.
Su base qualitativa le separazioni analitiche possono essere impiegate per una rapida identificazione delle sostanze presenti in una miscela. Se si presume che una data sostanza sia presente in una miscela, e se questa, sottoposta a separazioni analitiche, mostra un comportamento identico a quello di una sostanza nota (uno standard), con ogni probabilità le due sostanze sono uguali. Per definire il comportamento di due sostanze, si dovrebbero utilizzare tutte le tecniche ad alta risoluzione disponibili, sottoponendo contemporaneamente allo stesso procedimento le sostanze standard. Questo metodo di lavoro evita, al termine del processo di separazione, di dover analizzare la sostanza con metodi fisici per stabilirne la struttura.
Non sempre è necessario procedere preliminarmente all'isolamento e alla
purificazione delle molecole per saggiarne quantitativamente la
concentrazione nel materiale biologico, se la molecola possiede qualche
proprietà peculiare che si può sfruttare appunto per il suo dosaggio
quantitativo. Tali proprietà costituiscono un esempio di specificità biologica e
sono ben evidenziate quando si dosano gli enzimi negli estratti grezzi, nelle
cellule intatte e negli organuli cellulari. Nei casi in cui non vi sia una
proprietà così specifica da sfruttare, bisogna purificare la molecola almeno
fino a un certo grado prima di poterla analizzare.
Ogni procedimento di purificazione
implica una certa perdita di materiale. E' fondamentale che il numero dei
passaggi di purificazione sia ridotto al minimo, e quindi
le tecniche impiegate dovrebbero essere
quelle in grado di fornire la maggior risoluzione con la minor quantità di
materiale.
Di solito i metodi separativi ad alta risoluzione hanno capacità limitata e non
sono adatti per essere impiegati per separazioni su larga scala.
La procedura consueta nelle separazioni preparative è quindi quella di avere un primo passaggio con alta capacità anche se, di conseguenza, spesso scarsamente risolutivo. L'importanza di tecniche quali la precipitazione, la dialisi, l'adsorbimento, la cromatografia liquido- liquido su colonna, la distribuzione in controcorrente e l'elettroforesi in continuo risiede nel fatto che, sebbene non possano fornire un grado di risoluzione così elevato come altri metodi, possono però essere usate in successione, lavorando con quantità notevoli di materiale.
Per i passaggi finali della purificazione si possono poi utilizzare alcuni metodi a elevata risoluzione, quali ad esempio la cromatografia a scambio ionico, a esclusione molecolare e d'affinità, l'elettroforesi preparativa su gel, la GLC e la HPLC preparative.
I punti da considerare nel decidere tra una tecnica separativa e un'altra sono molti.
Ne citiamo alcuni:
1. potere risolutivo e/o capacità
della tecnica (aspetti determinati a seconda
che la separazione sia su larga scala o analitica)
2. proprietà fisiche della sostanza, ad esempio la sua solubilità,
volatilità, peso
molecolare e carica
3. stabilità della sostanza nel corso di un certo procedimento
4. esame critico delle procedure di separazione simili
eventualmente presenti in letteratura
5. disponibilità di apparecchiature e di personale qualificato
6. costo del procedimento.