i gel d'agarosio

i gel d'agarosio insieme a quelli di acrilamide vengono usati nella separazione di acidi nucleici.

La velocità della migrazione elettroforetica di quest'ultimi a doppia elica dipende da 4 principali parametri:

1. La grandezza molecolare dell'acido nucleico. Molecole lineari a doppia elica scorrono attraverso il gel ad una velocità inversamente proporzionale al log del loro peso molecolare. 

   M_r µ 1/log (Mw)

   massa molecolare  vs. velocità di migrazione attesa:

   massa molecolare (Da)	log (massa molecolare)	1/log (massa molecolare) es.  velocità di migrazione
   100,000	5.0	0.20
   50,000	4.7	0.21
   10,000	4.0	0.25
   5,000	3.7	0.27
   1,000	3.0	0.33

2. La concentrazione di agarosio. C'è una relazione lineare inversa tra il logaritmo della mobilità elettroforetica e la concentrazione del gel.

log (M_r) µ 1/[gel]

3. La conformazione dell'acido nucleico.

   • DNA circolare (forma I) - tipicamente superavvolto

   • circolare ma "nicked" cioè con una interruzione (forma II)

   • lineare (forma III)

   le tre forme di uno stesso DNA migrano diversamente: quasi sempre la forma III, lineare,  migra a velocità minore rispetto alle altre due. La forma superavvolta invece migra più velocemente.

   

    

4. Il voltaggio applicato.

   • un valore tipico è 5 volt per cm (lunghezza del gel)

I gel d'agarosio sono solitamente purificati e utilizzati orizzontalmente per via della scarsa consistenza del gel.

• i gel d'agarosio sono utili nella separazione di piccoli frammenti di DNA

  • tipicamente oligonucleotidi <100 paia di basi

  • questi gel solitamente hanno una concentrazione di acrilamide bassa (≤6%) e contengono l'agente denaturante Urea (6M)

    • l'agente denaturante impedisce la formazione di strutture secondarie e consente una relativa accuratezza nella determinazione del peso molecolare.

Il principale svantaggio di questo supporto è dovuto alla notevole elettrosmosi.

Il supporto infatti non è elettricamente inerte, ma adsorbe ioni come ad esempio fa la carta. Nel caso dell'agarosio sono i gruppi solfonati ad adsorbire ioni. Si viene a generare perciò una forza motrice che fa muovere verso il catodo gli ioni ossonio H₃O⁺, i quali trascinano con sé molecole prive di carica. Questo fenomeno accelera il movimento dei cationi e rallenta quello degli anioni.

Per gli acidi nucleici a singolo filamento la separazione avviene in base all'effetto di setaccio molecolare del gel dato che il rapporto carica/massa è praticamente costante, così come avviene per l'elettroforesi di proteine in presenza di SDS. Molecole più piccole migreranno più velocemente di molecole più grandi.

Come si rivelano gli acidi nucleici?

• il metodo più conveniente per visualizzare il DNA nel gel è colorarlo col colorante fluorescente bromuro d'etidio.

Questo composto contiene un gruppo planare che si intercala tra le basi "impilate" del DNA. L'orientamento e la vicinanza dell'etidio alle basi fa si che il colorante assuma una aumentata fluorescenza comparata a quella che ha quando è libero in soluzione.

• La radiazione U.V. a 254 nm è assorbita dal DNA e trasmessa al colorante legato

• l'energia viene riemessa a 590 nm nella regione rosso-arancio dello spettro

- il bromuro d'etidio è normalmente preparato come soluzione stock di 10mg/ml in acqua, mantenuta a temperatura ambiente e protetta dalla luce.

- viene normalmente incorporato nel gel e nel buffer di corsa, o viceversa, il gel viene colorato dopo la corsa impregnandolo in una soluzione di bromuro d'etidio (0.5 μg/ml per 30 min.)

• il colorante viene quindi visualizzato irradiando con raggi U.V. (ad esempio con un transilluminatore) e fotografandolo su un film polaroid.

• la sensibilità del rilevamento è solitamente migliore di 0.1 μg di DNA.

Dal momento che l'etidio è un agente intercalante, è un potenziale mutageno.

NOTA:

• L'intercalare  del colorante causa una riduzione nel numero delle effettive paia di basi per torsione (giro)  dell'elica. Questo fa si che il DNA adotti una conformazione utilizzando un numero inferiore di basi per giro => ciò significa un numero maggiore di giri per una data lunghezza di DNA. Il risultato netto è che introduce una tendenza al superavvolgimento negativo e così i superavvolgimenti positivi migrano in uno stato di rilassamento (verso la forma II)

• dopo la replicazione il DNA è tipicamente in forma underwound (ricca di avvolgimenti negativi) e col bromuro d'etidio questa tendenza aumenta (la velocità di migrazione può così rivelarsi maggiore di quella che dovrebbe essere dovuto al maggior compattamento).

L'ombreggiamento a fluorescenza:

• I frammenti di DNA possono essere visualizzati anche con questo metodo. Il gel viene posto su un materiale fluorescente, solitamente TLC silica plate. Il gel viene illuminato con raggi UV. Le bande di DNA nel gel bloccheranno la trasmissione  dei raggi UV al substrato. Questo provocherà la visione di bande scure (non fluorescenti) sul substrato.