Frammentazione delle proteine

Questa può essere fatta sia con metodi enzimatici che chimici.

Metodi enzimatici:si basano sull'uso di proteasi, endopeptidasi più o meno specifiche per alcuni residui a.acidici.

 

1. In questo caso R1 è riconosciuto e lasciato al C-terminale del frammento

 

2. In quest'altro caso R1 è riconosciuto e lasciato all'N-terminale del frammento

 

 

Enzima

Fonte

Specificità

Punti addizionali

Tripsina

 pancreas Bovino

peptide bond C-terminal to R, K, but not if next to P

highly specific for positively charged residues

Chimotripsina

pancreas Bovino

peptide bond C-terminal to F, Y, W but not if next to P

prefers bulky hydrophobic residues, cleaves slowly at N, H, M, L

Elastasi

pancreas Bovino

peptide bond C-terminal to A, G, S, V, but not if next to P

 

Thermolisina

Bacillus thermoproteolyticus

peptide bond N-terminal to I, M, F, W, Y, V, but not if next to P

prefers small neutral residues, can cleave at A, D, H, T

Pepsina

mucosa gastrica bovina

peptide bond N-terminal to L, F, W, Y, but when next to P

exhibits little specificity, requires low pH

Endopeptidasi V8

Staphylococcus aureus

peptide bond C-terminal to E

 

 

 

Metodi chimici:

  1. idrolisi acida parziale: HCl 6N per 10' a 110°C oppure HCl 12N per 24 ore a 37°C. Vengono prodotti tagli aspecifici e si generano frammenti di lunghezza molto variabile. E' possibile a volte sfruttare questa frammentazione per trovare "overlaps" senza ricorrere ad un secondo metodo.

alcuni legami sono particolarmente sensibili all'idrolisi

 

 

Principali problemi connessi con l'idrolisi con HCl

  1. Non è possibile determinare il contenuto di Gln e Asn

  2. Parziale distruzione di ser, Thr, Tyr

  3. Distruzione totale di trp

  4. Labilità e reattività dei gruppi -SH delle Cys (in buona parte vengono ossidati)

  5. ossidazione di met (minime)

  1. rottura dei legami Asp-Pro; idrolisi molto blanda della proteina. Acido acetico (CH3COOH) 30% per 1 ora a 100°C o HCl 1N 15-20 ore a 37°C.

  2. rottura dei legami Asn-Gly con idrossilammina (NH2OH), attraverso la formazione di un anello succinimmidico intermedio.

il legame peptidico a livello di alcuni residui può essere idrolizzato specificatamente con reazioni chimiche.

  1. Rottura a livello di Trp con

,è specifica per il Trp. Essendo Trp molto raro nelle proteine, questo taglio genera normalmente pochi frammenti molto lunghi.

  1. rottura a livello di Met con bromuro di cianogeno (CNBr)