L'elettroforesi

E' una metodologia di laboratorio che viene utilizzata per la separazione di molecole cariche in soluzione che migrano in modo differente in un campo elettrico in base al loro rapporto carica/massa e alla loro forma.

• Sono molte infatti le molecole d'interesse biologico che possiedono gruppi ionizzabili e possono esistere in soluzione come specie elettricamente cariche, amminoacidi, peptidi, proteine, nucleotidi, acidi nucleici.

• Anche composti tipicamente non ionici, come i carboidrati, possono assumere una carica se trasformati chimicamente, ad esempio come borati o fosfati.

• Inoltre molecole con carica simile ma di diverso peso molecolare, e quindi con un diverso rapporto q/m, presentano una migrazione differenziale se sottoposte ad un campo elettrico.

Principi generali

• L'apparecchiatura per l'elettroforesi è composta, fondamentalmente da due parti: un alimentatore e una cella elettroforetica . L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica e pertanto i cationi migrano verso il catodo (-) e gli anioni verso l'anodo (+) a una velocità che dipende dall'equilibrio tra la forza di spinta del campo elettrico e le forze frenanti (frizionali ed elettrostatiche) esistenti tra ioni e mezzo circostante.

• Perché l'elettroforesi abbia luogo, il campione va sciolto in un tampone, col quale va inoltre saturato l'eventuale supporto per consentire la conduzione della corrente. Il tampone serve, inoltre, per mantenere costante lo stato di ionizzazione delle molecole da separare, la cui carica cambia con il pH, soprattutto nel caso di ioni dipolari.

• La corrente è mantenuta lungo il circuito dall'elettrolisi che ha luogo agli elettrodi, entrambi i quali pescano in capaci recipienti contenenti il tampone. Durante l'elettrolisi, al catodo si producono ioni ossidrile e idrogeno, mentre all'anodo si producano ioni idrogeno e ossigeno.

Gli ioni ossidrile, prodotti al catodo, aumentano la dissociazione del componente acido debole (HA) della miscela tampone e ciò provoca un aumento della formazione di A^- che conduce corrente all'anodo. Qui gli ioni A^- si combinano con gli ioni H⁺ per riformare HA e vengano forniti elettroni al circuito elettrico.

NOTA: La maggior parte della corrente è pertanto condotta dagli ioni del tampone e  solo una piccola quota è condotta dagli ioni del campione.

• L'elettroforesi può essere condotta in soluzione libera,senza supporto ( nel qual caso si osserva una resistenza frizionale molto piccola tra ioni e soluzione e quindi un'elevata velocità di migrazione, questa condizione si verifica nell'elettroforesi  a flusso continuo) oppure con un supporto inerte e omogeneo. Si parla di elettroforesi a fronte mobile

• Quando l'elettroforesi è condotta su un supporto, i componenti del campione migrano come bande o "zone" distinte che, al termine della corsa, possono essere rivelate mediante opportune tecniche analitiche. Questo metodo che prende, quindi, il nome di elettroforesi zonale.
   

Il campo elettrico

• Se la distanza tra gli elettrodi è di d metri ed essi presentano uno differenza di potenziale di V volt, avremo un gradiente di potenziale di V/d volt m^-', ovvero un campo elettrico (E).

• La forza che si esercita su uno ione di carica q (in coulomb) è quindi Vq/d newton (Eq) e

• la velocità di migrazione sarà proporzionale a questa forza, ma inversamente proporzionale al coefficiente frizionale (f)

  

  Un aumento del gradiente di potenziale provocherà, quindi, un aumento proporzionale della velocità di migrazione.

• Quando tra due elettrodi viene applicata una differenza di potenziale si genera una corrente (misurata in couloumb sec^-1 o ampere), la cui intensità dipende dalla resistenza del mezzo ed è proporzionale al voltaggio applicati. In soluzione la corrente è condotta tra gli elettrodi principalmente dagli ioni del tampone e, in piccola misura, dagli ioni del campione. Un aumento del voltaggio provoca pertanto un aumento della carica complessiva trasportata sull'elettrodo.

• L'entità della migrazione degli ioni risulterà proporzionale sia alla corrente sia al tempo.

La legge di Ohm stabilisce una relazione tra corrente I (misurata in ampere A), voltaggio V (misurato in volt V) e resistenza R (misurata in ohm, Ω):  V=RI

• La resistenza dipende dal mezzo di supporto, dal tipo di tampone e dalla sua concentrazione. La resistenza aumenta con l'aumentare della distanza tra gli elettrodi, ma diminuisce con l'aumento sia dell'area della sezione trasversale del supporto, sia della forza ionica del tampone.

• Durante l'elettroforesi la potenza dissipata (W, misurata in watt) nel mezzo di supporto e pari a: W=I²R

Naturalmente si verificherà la produzione di calore nella cella con aumento della temperatura che provoca:

• una diminuzione della resistenza e questo effetto dipende, almeno in parte, da un aumento della mobilità ionica dovuto a una diminuzione di viscosità e quindi dell'attrito esercitato dal liquido rispetto al movimento degli ioni.

• Il riscaldamento provocherà, inoltre, evaporazione del solvente dal supporto e quindi diminuzione della resistenza, ma anche migrazione più lenta del campione per l'aumento di concentrazione.

=> Per ottenere risultati riproducibili, si utilizzano comunemente alimentatori stabilizzati, in grado cioè di mantenere costante il voltaggio o l'amperaggio rispetto a eventuali variazioni della resistenza dovute a fluttuazioni di temperatura.

• Applicando al sistema un voltaggio costante, la corrente tenderà ad aumentare ­ durante l'elettroforesi a causa della diminuzione di resistenza conseguente all'aumento di temperatura. Si avrà quindi un'ulteriore produzione di calore e maggior tendenza all'evaporazione del solvente, con gli effetti descritti in precedenza.

• Questi problemi però possono essere evitati lavorando a corrente costante anche se, in questo caso, si avrà una caduta del voltaggio ¯ applicato per diminuzione della resistenza e conseguente riduzione della velocità dì migrazione. L'alto voltaggio si usa soprattutto per la separazione di composti a basso peso molecolare. L'evaporazione del tampone è ridotta al minimo sigillando la cella con un coperchio a tenuta. Nel caso di alto voltaggio, nell'apparecchiatura è incorporato un sistema di raffreddamento.

Il campione

• La velocità dì migrazione aumenta all'aumentare della carica netta del campione. La grandezza della carica dipende, generalmente, dal pH, in base a quanto stabilito dell'equazione di Henderson-Hasselbalch.

• La velocità di migrazione diminuisce all'aumentare del peso molecolare e questo perché aumentano le forze frizionali ed elettrostatiche rispetto al mezzo circostante.

• Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (ad esempio proteine fibrose e proteine globulari) mostrano differenti caratteristiche di migrazione a causa del diverso effetto delle forze frizionali ed elettrostatiche.

Il tampone

• Il tampone determina e stabilizza il pH del mezzo di supporto e influenza anche la velocità di migrazione dei componenti del campione.

• I tamponi dì uso comune sono il formiato, l'acetato, il citrato, il barbitone, il fosfato, il Tris, l'EDTA la piridina.

• Il tampone non deve legarsi ai composti da separare, perché ne altererebbe la velocità di migrazione. In casi particolari, tuttavia, questo fenomeno può essere opportunamente sfruttato.

• Il tampone agisce come solvente del campione e quindi una certa diffusione è inevitabile, soprattutto nel caso di molecole piccole, come aminoacidi e zuccheri. Il grado di diffusione può essere ridotto evitando un sovraccarico di campione, applicandolo in bande mollo strette, usando un'alta tensione per il tempo più breve possibile e rimuovendo e fissando rapidamente il supporlo al termine della corsa.

Concentrazione

• All'aumentare della forza ionica del tampone la quota di corrente trasportata dal tampone aumenta mentre diminuisce la quota di corrente trasportata dal campione che abbassa, così, la sua velocità di migrazione.

• Inoltre un'elevata forza ionica del tampone incrementa la corrente totale e quindi la produzione di calore.

• Viceversa a bassa forza ionica la quota di corrente trasportata dal tampone diminuisce e aumenta la quota di corrente trasportata dal campione che incrementa, così, la sua velocità dì migrazione.

• Una bassa forza ionica del tampone riduce la corrente totale e determina quindi una minor produzione di calore. Tuttavia la diffusione e la conseguente perdita di risoluzione sono maggiori.

• Perciò la scelta della forza ionica dovrà, in sostanza, rappresentare un compromesso tra questi due estremi: essa è infatti normalmente compresa tra 0,05 e 0,10 M.
   

Il pH

• Ha poco effetto sui composti completamente ionizzati, ad esempio i sali inorganici, mentre determina il grado di ionizzazione dei composti organici dissociabili. La dissociazione degli acidi organici aumenta all'aumentare del pH, mentre il contrario accade per le basi organiche. In entrambi i casi la velocità di migrazione risulta peraltro dipendente dal pH. Per composti come gli aminoacidi, che hanno proprietà sia acide sia basiche (anfoliti) si avranno entrambi gli effetti del pH:

• Pertanto, sia la direzione sia la velocità di migrazione degli anfoliti dipendono dal pH. I tamponi usati per la loro separazione hanno un pH compreso fra 1 e 11.

• Se il tampone presente nelle due camere è lo stesso utilizzato per saturare il supporto, si parla di sistema continuo.

• Se il tampone presente nelle due camere non è lo stesso utilizzato per saturare il supporto, si parla di sistema discontinuo (ad esempio per il gel di poliacrilamide in presenza di SDS)

 Il supporto

Sebbene come supporto vengano utilizzati materiali relativamente inerti, essi possono presentare effetti di adsorbimento, di elettro-osmosi e di filtrazione molecolare che modificano la velocità di migrazione dei componenti.

I supporti comunemente usati per l'elettroforesi zonale sono:

1. Cellulosa

2. Acetato di cellulosa

3. Silice (gel)

4. Amido (gel)

5. Agarosio (gel) vedi: i gel d'agarosio

6. poliacrilamide (gel) vedi: i gel di poliacrilamide

7. Sephadex (gel)

• Nelle separazioni di sostanze ad alto peso molecolare, come le proteine e gli acidi nucleici, l'uso dei gel come mezzo di supporto ha ampiamente sostituito i sistemi elettroforetici a basso voltaggio su carta e su strato sottile, in quanto questo mezzo offre un maggior potere risolutivo.

• I gel si preparano subito prima dell'uso partendo da solidi in polvere quali amido, agar, acrilamide.

• Le molecole più piccole si possono invece separare solo su gel di Sephadex.

Rivelazione e identificazione

- Si sfrutta l'assorbimento e o la fluorescenza nell'ultravioletto. Ad esempio per gli acidi nucleici e le proteine in gel di poliacrilamide si sfrutta l'assorbimento a 260-280 nm.

- per un'analisi nel visibile si ricorre a una colorazione preventiva. L'eccesso di colorante deve essere rimosso. Prima di ogni colorazione però l'elettroforegramma deve essere fissato per ridurre la diffusione delle bande. (vale soprattutto per l'IEF). La soluzione di fissaggio può essere ad esempio acido tricloroacetico al 10% (per 30 minuti). Poi i campioni vengono colorati per 10 minuti col colorante appropriato (Blu Coomassie Brilliant R-250 per le proteine ad esempio). L'eccesso di colorante deve essere rimosso con ripetuti lavaggi in un decolorante (una soluzione acquosa di etanolo al 25% e acido acetico all'8%)

   un'altro tipo di colorazione prevede l'uso del nitrato d'argento. La sensibilità in questo caso è due volte maggiore che col Coomassie (può rivelare 1 ng di proteina)

- la rivelazione degli enzimi avviene non fissando l'elettroforegramma e impiegando le tecniche di istochimica, in cui il substrato di un enzima si trasforma in un prodotto colorato insolubile. Il gel quindi viene fatto venire in contatto col substrato in condizioni tali che l'attività enzimatica sia ottimale.

- se invece il composto è radioattivo si procederà con l'autoradiografia.