La degradazione di Edman: con questo metodo è possibile ottenere l'intera sequenza peptidica. Viene utilizzato fenilisotiocianato (PTC) che reagisce con i residui N-terminali in condizioni alcaline. Il risultante aminoacido feniltiocarbamil derivato viene idrolizzato in acido anidro. La reazione di idrolisi porta alla formazione di una forma anilinotiazolinone dell'aminoacido e rigenera l'estremità libera amminica del peptide. Gli ATZ-aminoacidi sono solubili in solventi organici come l'acetato di etile e possono essere estratti dalla proteina insolubile per un analisi. L'ATZ-aminoacido viene quindi convertito a un feniltioidantoin derivato in una reazione separata. I PTH-aminoacidi sono più stabili e un pò meno sensibili alla cromatografia.
Come nei metodi precedenti il residuo aminoterminale presenta un marcatore identificabile, tuttavia il vantaggio con quest'ultima tecnica è che il peptide restante rimane intatto. In questo modo la intera sequenza di reazioni può essere ripetuta fino a ottenere la sequenza del peptide. E' stata quindi automatizzata per consentire un sequenziamento rapido e efficiente di quantità anche molto piccole di peptide. I PTH-aminoacidi possono essere rapidamente separati su HPLC in fase inversa.
Un aminoacido può essere identificato comparando il suo profilo con questo. Un sequenziatore "a fase gassosa" di ultima generazione può analizzare peptidi nell'ordine delle picomoli. Questa alta sensibilità rende possibile analizzare la sequenza di un campione proteico preso direttamente dalla banda di un gel SDS-poliacrilamide o da un gel da IEF.
Schema di un sequenziatore automatico di proteine
A causa delle limitazioni di questa tecnica, ovvero accumuli d'errori e reazioni collaterali, peptidi più lunghi di circa 50 residui non possono essere sequenziati. Il massimo numero di residui dipende dall'idrofobicità, la purezza, la quantità e la sequenza degli aminoacidi.
Modificazione delle cisteine: cisteine non modificate non possono essere sequenziate e devono quindi essere modificate .
Bloccaggio N-terminale: se l'aminoterminale è bloccato il peptide non può essere sequenziato con la degradazione di Edman.
Glicosilazioni e altre modificazioni: aminoacidi glicosilati e fosforilati possono dare "cicli bianchi", picchi ridotti o altri tempi di ritenzione.
La possibilità di ottenere peptidi di questa lunghezza a partire da una proteina di lunghezza maggiore, ci è data dalle endopeptidasi, enzimi che tagliano in punti specifici all'interno della sequenza primaria delle proteine. I peptidi ottenuti possono essere cromatografati separatamente su HPLC e sequenziati.
Specificità di alcune endopeptidasi
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Enzima |
Fonte |
Specificità |
Punti addizionali |
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Tripsina |
pancreas Bovino |
peptide bond C-terminal to R, K, but not if next to P |
highly specific for positively charged residues |
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Chimotripsina |
pancreas Bovino |
peptide bond C-terminal to F, Y, W but not if next to P |
prefers bulky hydrophobic residues, cleaves slowly at N, H, M, L |
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Elastasi |
pancreas Bovino |
peptide bond C-terminal to A, G, S, V, but not if next to P |
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Thermolisina |
Bacillus thermoproteolyticus |
peptide bond N-terminal to I, M, F, W, Y, V, but not if next to P |
prefers small neutral residues, can cleave at A, D, H, T |
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Pepsina |
mucosa gastrica bovina |
peptide bond N-terminal to L, F, W, Y, but when next to P |
exhibits little specificity, requires low pH |
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Endopeptidasi V8 |
Staphylococcus aureus |
peptide bond C-terminal to E |
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La degradazione di Edman impone anche un
numero di restrizioni alla composizione delle proteine da
analizzare. I campioni dovrebbero essere generalmente liberi da sali, da
amine primarie e detergenti. Tali contaminanti possono essere rimossi prima del
sequenziamenti con passaggi di purificazione appropriati (es. cromatografia
liquida, precipitazione, dialisi). Le proteine campione da caricare dovrebbero
essere in un solvente volatile come acqua, acetonitrile, propanolo, acido
acetico, acido formico o in forma liofilizzata. Alternativamente possono
trasferite con un elettroblotting su membrane inerti (es. PVDF,
polivinilidene difluoruro) usando CAPS o tampone borato per il trasferimento dal
gel.
La strategia di sequenziamento:
L'approccio usuale consiste nel digerire la proteina con proteasi in modo da generare peptidi più piccoli e sequenziare quest'ultimi. Il problema è però ordinare correttamente i peptidi. Questo viene risolto usando due peptidasi che tagliano la proteina in punti diversi, in modo da generare delle estremità sovrapponibili. I peptidi vengono quindi separati per HPLC e sequenziati.
Quando è possibile farlo, il sequenziamento anche di una piccola porzione della proteina consente di ricavare una sonda oligonucleotidica con la quale identificare il gene corrispondente. La proteina verrà quindi sequenziata più agevolmente direttamente dalla sequenza del gene.
Alla luce di quanto detto ecco la descrizione dell'approccio classico al sequenziamento di una proteina.
determinazione della composizione a.acidica e del peso molecolare della proteina. Nota: Se la proteina è oligomerica bisogna separare le catene e valutarle separatamente.
frammentazione della proteina (metodi chimici ed enzimatici)
Separazione e purificazione dei peptidi
Sequenziamento di ciascuno di essi (Edman)
Ricostruzione della sequenza a.acidica in base alla sovrapposizione dei due sets di peptidi sequenziati sfruttando gli "overlaps" (zone comuni).
Determinazione della sequenza N-terminale della proteina intera per determinare la sequenza a partire dall'estremità N-terminale.
Schema
