Se si conosce la struttura primaria di una proteina è possibile determinare la sequenza di un'altra proteina ad essa omologa mediante spettrometria di massa.
si procede con identica frammentazione enzimatica e/o chimica delle due proteine ridotte e derivatizzate.
si fa quindi la "mappatura" delle due miscele di frammenti con relativa assegnazione dei segnali lungo la sequenza della proteina di riferimento. Molti segnali saranno identici, ma altri differiranno giacchè alcuni peptidi conterranno uno o più aminoacidi diversi o anche aminoacidi in meno o in più.
segue una convalida delle assegnazioni fatte effettuando uno o più passi di Edman sulla miscela della proteina a sequenza sconosciuta ed analizzando gli spettri risultanti (oppure sulla miscela dopo trattamento con carbossipeptidasi)
Pregi della procedura: le analisi vengono condotte in miscela, senza dover purificare i frammenti
Difetti: mancanza di qualche segnale, mancanza di sicurezza nelle assegnazioni fatte.
La strategia impiegata può essere così riassunta:
riduzione e derivatizzazione (es. carbossimetilazione, piriletilazione, etc.) del componente proteico a sequenza incognita (seq. X) e della proteina a sequenza nota (seq. K)
idrolisi chimica e/o enzimatica delle due proteine derivatizzate seguita da analisi spettrometrica di massa FAB delle due miscele peptidiche
comparazione dello spettro di massa (FAB-fingerprint) della proteina incognita con quello ottenuto analizzando la proteina a sequenza nota.
individuazione dei segnali di massa comuni ai due fingerprints e loro assegnazione a sequenze peptidiche ben definite. Questa assegnazione viene effettuata sulla base della sequenza nota della proteina K e della specificità del metodo di frammentazione impiegato (punto 2)
I "pochi" segnali di massa presenti solo nel fingerprint della proteina a sequenza incognita vengono tentativamente assegnati a frammenti peptidici sulla base del:
loro valore di massa
della sequenza nota della proteina omologa di confronto
di un programma computerizzato in grado di analizzare tutte le possibili sostituzioni, delezioni o inserzioni di residui amminoacidici
la conferma delle assegnazioni viene effettuata rianalizzando con lo spettrometro di massa FAB, le due miscele di peptidi dopo averle sottoposte a semplici trattamenti chimici e/o enzimatici (degradazione di Edman, idrolisi con CpB, etc..)