Un adsorbente può essere definito come un solido che ha le proprietà di tener legate molecole alla sua superficie, particolarmente quando è poroso e finemente diviso.
L'adsorbimento può essere abbastanza specifico e, pertanto, un soluto può essere selettivamente adsorbito a partire da una miscela eterogenea.
La cromatografia di adsorbimento può essere eseguita sia su colonna sia su strato sottile.
La fase stazionaria può essere costituita da acido silicilico (gel di silice), ossido d'alluminio, carbonato di calcio, carbonato di magnesio, carbonato di zinco, ossido di magnesio o cellulosa.
L'idrossiapatite (fosfato di calcio) è l'adsorbente che più comunemente viene usato per la separazione di proteine, acidi nucleici e virus, perché, a differenza di altri adsorbenti, possiede alcune proprietà di scambio ionico che migliorano la separazione.
Molti adsorbenti tendono ad assorbire umidità dall'aria, mutando così le loro proprietà. in questo caso è necessario attivare l'adsorbente scaldandolo a 110°C per il tempo necessario a rimuovere l'acqua.
Caratteristiche della fase mobile:
La polarità paragonabile è paragonabile a quella dell'analita più polare presente nella miscela di composti da separare.
1) alcoli se gli analiti contengono -OH
2) acetoni o esteri se gli analiti contengono
3) idrocarburi (esano, eptano, toluene) se gli analiti sono apolari
NOTA: se la silice è la fase stazionaria è spesso richiesta la presenza di una piccola quantità d'acqua nella fase mobile, poiché le molecole d'acqua bloccano i gruppi -SiOH più reattivi lasciando una popolazione di siti più deboli.
HIC - Cromatografia (d'adsorbimento) per interazioni idrofobiche
Di elezione per la purificazione di proteine in base alla loro idrofobicità di superficie correlata alla presenza di residui a.acidil apolari.
Principio:
Una molecola proteica in soluzione è circondata da un film di H2O in ordinata struttura. Questo film deve essere rimosso mediante ioni (NH4+,SO42-...) che, coordinando le molecole d'acqua sulla superficie della proteina, fanno in modo che i gruppi idrofobici della molecola possano interagire con quelli della fase stazionaria.
- L'interazione è incrementata aumentando la forza ionica, infatti le proteine vengono fatte legare in condizioni di alte concentrazioni saline e vengono eluite in condizioni di basse concentrazioni.
- In questo modo le colonne non solo vengono usate per purificare , ma anche per togliere sali dai campioni (ad esempio dopo una iniziale purificazione con soldato d'ammonio).
- Solitamente non è possibile predire in anticipo quale particolare resina legherà una data proteina, viene determinato empiricamente. Comunque, più l'alcano è lungo o più il gruppo aromatico è largo e più forte sarà il legame.
Le fasi stazionarie idrofobiche sono: Octyl-agarose, Phenyl-agarose che contengono gruppi funzionali non-polari come alcani o gruppi aromatici.
La miscela proteica viene disciolta in un tampone di alta forza ionica [1M(NH4)2SO4]
Si userà
o un gradiente di forza ionica che deve essere discendente
oppure si usa un gradiente di pH crescente per aumentare l'idrofilicità della proteina
oppure lo spiazzamento selettivo mediante molecole che hanno una affinità per la fase stazionaria maggiore di quella della proteina.
Grazie alla natura delle interazioni idrofobiche e alla forza ionica, la cromatografia idrofobica e la cromatografia di scambio ionico possono convenientemente essere usate sequenzialmente. Ad esempio, dopo uno scambio ionico la proteina si trova in condizioni di alta concentrazione salina, in questo modo può essere caricata direttamente su una colonna idrofobica. Al contrario, una colonna idrofobica viene eluita in condizioni di bassa concentrazione salina che è un requisito per far legare le proteine su una resina a scambio ionico.
Bisogna fare una distinzione tra la cromatografia a interazione idrofobica e la cromatografia a fase inversa.
l'HIC viene svolta con un solvente acquoso e con variazioni di forza ionica per eluire la colonna. Le proteine tipicamente si legano nella forma nativa attraverso gruppi idrofobici presenti sulla loro superficie. Lo stato nativo viene mantenuto durante le condizioni di eluizione.
La cromatografia a fase inversa utilizza un solvente idrofobico (tipicamente acetonitrile) e il legame di un ligando è una funzione della partizione di fase tra la natura idrofobica del solvente e i gruppi funzionali della colonna. Le proteine in questi solventi sono tipicamente denaturate e si legano grazie alla natura idrofobica su di un'intera sequenza polipeptidica. Dal momento che la maggior parte dei gruppi idrofobici sono localizzati nel core delle proteine globulari, il legame è possibile grazie alla denaturazione della proteina. le proteine possono essere purificate usando la cromatografia a fase inversa, ma solitamente devono essere rinaturate per riottenere la funzionalità.