Cromatografia a scambio ionico

• Il principio su cui si basa questo tipo di cromatografia è l'attrazione che si verifica tra molecole cariche di segno opposto. molti materiali biologici, ad esempio amminoacidi e proteine, possiedono gruppi ionizzabili e il fatto che essi possono portare una carica netta positiva o negativa può essere utilizzato nella separazione di miscele che li contengano. La carica netta che questi composti presentano dipende dal loro pK_a e dal pH della soluzione secondo l'equazione di Henderson-Hasselbalch.

• Le separazioni a scambio ionico sono condotte in colonne impaccate con una resina scambiatrice di ioni. esistono due tipi di resine: gli scambiatori anionici e gli scambiatori cationici. Questi ultimi possiedono gruppi carichi negativamente e attraggono, quindi, molecole cariche positivamente. Sono anche chiamati materiali acidi a scambio ionico, perché le loro cariche negative risultano dalla protolisi di gruppi acidi.

Il meccanismo di scambio ionico si compone di 5 fasi distinte.

1. Diffusione dello ione alla superficie della resina.

2. Diffusione dello ione attraverso la matrice della resina verso il sito di scambio.

3. Spiazzamento dello ione al sito di scambio.

Negli scambiatori cationici:
Negli scambiatori anionici:

Quanto maggiore è la carica della molecola da scambiare, tanto più forte è il legame con la resina e tanto meno facilmente essa può essere sostituita da altri ioni.

4. Diffusione del controione attraverso la resina.

5. Distacco selettivo, a opera di un eluente, e diffusione della molecola nella soluzione esterna. L'eluizione selettiva delle molecole legate alla resina si ottiene variando il pH o la forza ionica o entrambi, oppure mediante l'eluizione di affinità. In quest'ultimo caso viene introdotto nel sistema uno ione dotato di maggiore affinità per lo scambiatore di quella della molecola legata.

Materiali

Molti scambiatori ionici sono costituiti da polimeri di stirene e di divinilbenzene (polistirene). Il polistirene, come tale, è un polimero lineare, solubile in numerosi solventi. Condensando invece stirene con divinilbenzene si ottengono polimeri con legami crociati e quindi insolubili. Copolimerizzando percentuali variabili di divinilbenzene e di stirene si ottengono resine con vario grado di legami crociati. Tanto maggiore è la quantità di divinilbenzene impiegato rispetto allo stirene, tanto più numerosi saranno i legami crociati presenti.

Le resine a basso contenuto di legami crociati sono più permeabili ai composti ad alto peso molecolare, ma sono anche meno rigide e, se poste in un tampone, si rigonfiano maggiormente delle resine ad alto contenuto di legami crociati.

Uno dei limiti principali delle resine a scambio ionico convenzionali è dato dal fatto che la loro efficacia si basa sullo scambio degli ioni che diffondono nella matrice.

Come alternativa alle resine polistireniche hanno avuto un largo impiego le cellulose modificate chimicamente: ad esempio la carbossimetilcellulosa (CM-cellulosa) e la DEAE-cellulosa, in cui i gruppi -CH₂OH sono trasformati rispettivamente in gruppi -CH₂OCH₂COOH e -CH₂OCH₂CH₂N(CH₂-CH₃)₂. Ciascun tipo è sottoforma di gel o di particelle sferiche con buone proprietà di flusso e di scambio. Analoghi ai derivati della cellulosa sono i derivati del destrano e dell' agarosio (Sephadex e Sepharose), usati in particolare nelle separazioni di proteine a elevato peso molecolare e di acidi nucleici.

Tutti gli scambiatori vengono messi in commercio legati a un adatto controione, solitamente sodio o cloruro. In alcuni casi, una volta caricato lo scambiatore nella colonna , può essere necessario un pretrattamento con acido o alcali per legare il controione desiderato.

Procedura e applicazioni

• La scelta dello scambiatore dipende dalla stabilità del campione, dal peso molecolare dei suoi componenti e dalle esigenze che la separazione presenta.

• Molti composti d'interesse biologico, soprattutto le proteine, sono stabili solamente in uno stretto intervallo di pH, per cui lo scambiatore dovrà funzionare entro i limiti di questo intervallo.

• Se il campione è più stabile a valori di pH inferiori al suo punto isoionico, cioè quando ha una carica netta positiva, si dovrà usare uno scambiatore di cationi, mentre sé è più stabile a valori di pH superiori al suo punto isoionico, cioè quando ha una carica netta negativa, si dovrà usare uno scambiatore di anioni.

• Se è stabile in un ampio intervallo di pH, si potranno usare entrambi i tipi di scambiatore.

• Anche nella scelta tra uno scambiatore forte e uno debole occorre valutare la stabilità del campione e l'effetto del pH sulla carica del campione.

• Gli scambiatori deboli vanno bene per separare elettroliti forti.

• Il tipo di scambiatore sarà scelto anche in base al peso molecolare dei componenti da separare.

Le proteine si legano a resine a scambio ionico tramite interazioni non ioniche non-covalenti (ponti salini). Possiamo competere per questi siti di legame con altri gruppi ionici, i sali.

• Il pH del tampone impiegato è normalmente superiore o inferiore di almeno un'unità rispetto al punto isoionico dei composti da separare. Nel caso degli scambiatori anionici i tamponi cationici più usati sono il Tris, la piridina e le alchilamine; nel caso degli scambiatori cationici i tamponi più usati sono l'acetato, il barbiturato e il fosfato. Il pH e la forza ionica iniziali devono essere tali da consentire il legame allo scambiatore di tutti i componenti del campione. Analogamente, nell'eluizione si dovrà usare un tampone alla forza ionica più bassa richiesta per l'eluizione dei componenti. Ciò assicura che, all'inizio, si leghi la più piccola quantità possibile di sostanze indesiderate e che, durante l'eluizione, queste restino il più possibile legate alla colonna.

In generale ci sono 3 tipi di metodi  di eluizione con una soluzione salina: 1. l'eluizione isocratica 2. l'eluizione con gradiente e 3. l'eluizione discontinua (a step)

• In quella isocratica si usa sempre lo stesso tampone dall'inizio alla fine.

• In quella con gradiente la transizione della concentrazione salina è lineare (dalla più bassa alla più alta). Le proteine legate debolmente escono per prime quelle più fortemente per ultime.

• Normalmente, se si usa per l'intera eluizione il tampone di partenza (eluizione isocratica), il volume del campione deve rappresentare l'1-5% del volume del letto della colonna.

• Al contrario, nel caso di eluizione tramite gradiente, si sceglieranno condizioni tali per cui tutto il campione possa legarsi allo scambiatore in cima alla colonna: in questo caso il volume del campione è praticamente poco importante e si possono quindi applicare anche grandi volumi di campione diluito, introducendo, di fatto, una tappa di concentrazione.

• L'eluizione tramite gradiente è di gran lunga più usata di quella isocratica.

• se conosciamo il "range" di concentrazione salina nel quale la nostra proteina di interesse sarà eluita possiamo semplicemente eluire con un tampone contenente quella concentrazione salina. Questa è l'eluizione discontinua (a step). Generalmente le eluizioni discontinue sono più veloci ed eluiscono la proteina in un volume complessivo minore che non le eluizioni con gradiente.

Lavorano bene quando i contaminanti vengono eluiti a concentrazioni saline significativamente diverse dalla proteina d'interesse. Questo tipo di eluizione fornisce inoltre una migliore risoluzione e picchi più simmetrici. Generalmente, nel caso di uno scambiatore di anioni, il pH del gradiente diminuisce e la forza ionica aumenta, mentre, nel caso di uno scambiatore di cationi, aumentano sia il pH che la forza ionica.

• in generale far diminuire la pendenza di un gradiente (incrementando il suo volume) ha come risultato un aumento della risoluzione (vedi figura sotto). Attenzione: questo significa anche aumentare la diluizione del campione che verrà raccolto.

Un gradiente di concentrazione salina può essere fatto, nel modo più semplice, con due contenitori (devono avere la stessa forma e dimensione) connessi da un sifone (non è nient'altro che un tubicino che li collega alla base). Un contenitore avrà il tampone salino a bassa concentrazione e l'altro ad alta conc. Il tampone fuoriesce dal contenitore con bassa conc.salina.

un esempio di mixer

Questo produrrà un gradiente lineare, da bassa concentrazione ad alta.

Esempio 1: La separazione di aminoacidi (ottenuti, ad esempio, dall'idrolisi di una proteina) si effettua su uno scambiatore di cationi acido forte. Il campione viene introdotto nella colonna a un pH 1-2, per far sì che tutti gli aminoacidi si leghino. L'eluizione si ottiene, poi, mediante un gradiente in cui aumentano pH e forza ionica. Gli aminoacidi acidi (aspartico e glutamico) vengono eluiti per primi, seguiti dagli aminoacidi neutri, come glicina e valina, mentre gli aminoacidi basici, lisina e arginina, mantengono la carica positiva fino a pH 9-11 e vengono eluiti per ultimi. Questi principi si realizzano nell'apparecchiatura automatica, nota come analizzatore di aminoacidi.

Esempio 2: La cromatografia a scambio ionico delle proteine si compie invece su scambiatori acidi o basici deboli derivati dalla cellulosa o da altri polisaccaridi.

• in genere i campioni vengono caricati in condizioni di bassa forza ionica e le sostanze che si legano alla colonna vengono eluite  usando o un eluizione a gradiente o a step di un tampone che ha una forza ionica più alta.

• una proteina si legherà a una resina a scambio cationico se il pH del tampone è più basso del suo punto isoelettrico (pI) e si legherà ad una resina a scambio anionico se il pH del tampone è più alto del suo pI.

• la conoscenza del punto isoelettrico è quindi utile nel disegnare un protocollo di purificazione usando resine a scambio ionico.

Le proteine con punto isoelettrico inferiore a 7 sono separate su DEAE cellulosa, usando un tampone a bassa forza ionica e a pH 8-9. Le proteine con punto isoelettrico maggiore di 7 possono essere separate su CM cellulosa, usando un tampone a pH 4-5. Le proteine con punto isoelettrico intorno a 7 possono essere separate con entrambi i tipi di scambiatore e la scelta dipenderà dalla stabilità delle proteine in ambiente debolmente acido o debolmente basico.

In definitiva le applicazioni della cromatografia a scambio ionico riguardano:

1. separazione di molecole organiche cariche

2. separazione di ioni metallici (es. Ca²⁺ e Mg²⁺)

3. separazione di proteine e polisaccaridi ricorrendo a matrici di cellulosa, destrani e poliacrilammide

4. separazione di nucleotidi, aminoacidi ricorrendo a resine a base di destrani e poliacrilammide.

5. Impiego alternativo alla gel-filtrazione per rimuovere sali da molecole piccole. Ad esempio la resina AG-11-A8 (Bio-Rad) contiene sia sali di ammonio quaternari (+) che gruppi carbossilici (-).

6. Preparazione di H₂O deionizzata con resine a letto misto.

7. In alternativa alla dialisi per rimuovere ioni bivalenti da soluzioni proteiche (di metalloproteine) con resine tipo CHELEX (Bio-Rad) a base di imminodiacetato.