Per la separazione di molecole in base alla loro forma e al loro peso molecolare vengono utilizzate le proprietà di setaccio molecolare che sono proprie di numerosi materiali porosi. I materiali più comunemente usati a questo scopo sono un gruppo di polimeri presenti sotto forma di un reticolo tridimensionale poroso che conferisce loro proprietà di gel. Per tale motivo si usa solitamente il termine gel filtrazione per descrivere la separazione di molecole di varia grandezza che utilizza questi materiali. Nel caso, invece, che vengano usati come setacci molecolari granuli di vetro poroso, si parla di cromatografia su vetro a porosità controllata.
Pertanto, con il termine cromatografia a esclusione o di permeazione, vengono indicati, in generale, tutti quei processi di separazione che sfruttano setacci molecolari.
La cromatografia a esclusione si fonda su un principio abbastanza semplice: una colonna di particelle di gel (gel filtrazione) o di granuli di vetro poroso è in equilibrio con un solvente adatto alle molecole da separare. Le molecole più grandi, completamente escluse dai pori, passano attraverso gli spazi interstiziali, mentre le molecole più piccole si distribuiscono nel solvente presente sia all'interno sia all'esterno del setaccio molecolare e attraversano quindi la colonna a velocità più bassa.
=> se la nostra proteina è molto più "piccola" o molto più "grande" comparata alle altre molecole "contaminanti" del campione la gel filtrazione lavorerà in maniera soddisfacente
La distribuzione di un soluto lungo la colonna è legata unicamente al volume totale di solvente (tanto interno quanto esterno alle particelle di gel) a questo accessibile.
Per ciascun tipo di gel il coefficiente di distribuzione Kd di un determinato soluto tra il solvente interno e quello esterno è funzione del peso molecolare del soluto. Se la molecola del soluto è così grande da essere esclusa dal solvente interno al gel, Kd è = 0. Se invece il soluto è abbastanza piccolo da essere liberamente permeabile alle particelle di gel, Kd è = 1.
Il volume di eluizione di un soluto, Ve, dipende da tre fattori: dal volume vuoto Vo, (il volume esterno alle particelle di gel), dal coefficiente di distribuzione e dal volume interno alle particelle di gel, Vi. Pertanto
 Vo |
 Vx |
 Vt |
Vo=volume vuoto Vt=volume totale Vi=volume della fase mobile all'interno del gel Vg=volume del gel |
|
Vt=Vo+Vi+Vg Vt-Vo =+Vi+Vg Vt- Vg=Vo+Vi |
|||
|
Ve=volume di eluizione della specie molecolare
|
Il coefficiente di distribuzione può essere calcolato da questa equazione:
per le molecole escluse Kd=0
Kd=1
Il valore di Vi può essere calcolato conoscendo il peso secco del gel (a) e il coefficiente di rigonfiamento (Wr, water regain)
Per due composti di diverso peso molecolare e quindi di diversa Kd(K'd e K''d), la differenza tra i volumi di eluizione, Vs, è:
Ne consegue che per ottenere una completa separazione dei due composti il volume di campione applicato non dovrà essere maggiore di Vs. Il rapporto tra volume di campione e volume interno influenza sia l'accuratezza della separazione, sia la diluizione del campione lunga la colonna.
Ma dove sarà eluita una proteina in un esperimento di gel filtrazione?
Ci sono due estremi nel profilo di separazione di una colonna di gel filtrazione
Esiste una massa molecolare "critica" (la massa grande) che sarà completamente esclusa dai canalicoli dei granuli di gel. Tutti i soluti nel campione che sono uguali , o più larghi, di questa grandezza critica si comporteranno in maniera identica: saranno eluiti nel volume "escluso" della colonna.
Esiste una massa molecolare "critica" (la massa piccola) che sarà completamente inclusa nei canalicoli dei granuli di gel. Tutti i soluti nel campione che sono uguali , o più piccoli, di questa grandezza critica si comporteranno in maniera identica: saranno eluiti nel volume "incluso" della colonna.
I soluti che si troveranno tra questi due range di massa molecolare saranno eluiti tra i volumi "escluso" e "incluso"
Come regola generale il volume escluso è approsimatamente uguale a 1/3 del volume di colonna, il volume incluso è approssimatamente uguale a 2/3 del volume di colonna
Nella gel filtrazione la risoluzione è funzione della lunghezza della colonna (più è lunga e meglio è)
Uno svantaggio consiste nel massimo volume di campione che può essere caricato. Più grande è il volume di campione caricato, più ci sarà sovrapposizione dei picchi separati. In generale la quantità di campione da caricare dovrebbe essere limitato al 3-5% del volume totale di colonna.
La gel filtrazione può anche essere usata per rimuovere sali dal campione.
In definitiva, può essere annoverata tra i metodi di purificazione "più gentili" grazie alla mancanza di interazioni chimiche con la resina.
Oltre che su colonna, la gel‑filtrazione può essere condotta su strato sottile.
La gel filtrazione su strato sottile (TLG)
Nella TLG si stratifica su una lastra di vetro il gel rigonfio. Il solvente presente negli interstizi costituisce la fase mobile. A differenza che nella TM la lastra non va essiccata e non si ha un flusso di solvente.
La lastra per TLG è posta in un contenitore chiuso, ed è collegata a entrambi i lati, per mezzo di ponti di carta da filtro, con recipienti contenenti il solvente. La lastra è inoltre inclinata di 20° circa per facilitare lo scorrimento della fase mobile. L'equilibramento deve durare almeno 12 ore. Si può anche tenere la lastra in posizione orizzontale e provocare il flusso del solvente ponendo a diverso livello i recipienti che lo contengono.
Il campione viene applicato sotto forma di macchia o di banda e la lastra è lasciata correre per un tempo opportuno. Dopo la corsa le macchie risolte vengono evidenziate con metodi appropriati.
La TLG viene adottata per la separazione di sostanze idrofile che richiedono condizioni sperimentali blande, come proteine, peptidi, acidi nucleici. Sostanze , cioè, ad alto peso molecolare.
Il maggior vantaggio della TLG rispetto alla gel filtrazione su colonna è che possono essere cromatografati contemporaneamente, e nelle stesse condizioni, numerosi campioni. Inoltre è possibile applicare quantità molto piccole di campione, il che rappresenta una caratteristica senz'altro ideale nelle applicazioni cliniche.
Materiali
I gel usati comprendono destrani a legami crociati (nome depositato Sephadex), agarosio (Sepharose Bio‑Gel A, Sagavac), poliacrilamide (Bio‑Gel P), poliacriloilmorfolina (Enzocryl Gel) e polistireni (Bio‑Beads S).
I gel di destrano si ottengono legando fra loro, con epicloridrina, molecole del polisaccaride. Con questo trattamento il destrano diventa insolubile in acqua, ma mantiene le sue caratteristiche idrofile e si rigonfia facilmente in un mezzo acquoso, formando particelle di gel adatte alla gel‑filtrazione. Variando la percentuale di legami crociati tra le molecole di destrano si sono ottenuti i vari tipi di Sephadex che differiscono tra loro per la grandezza dei pori e che pertanto possono essere usati in un ampio intervallo di pesi molecolari. In ciascun tipo di gel si osserva una certa variabilità della grandezza dei pori dovuta alla distribuzione casuale dei legami crociati, ed è per questo che molecole che, in teoria, dovrebbero essere escluse dal gel, possono penetrarvi parzialmente. Ciascun tipo di Sephadex è inoltre caratterizzato dal suo coefficiente di rigonfiamento, cioè dalla quantità d'acqua assorbita da un grammo di peso secco di gel per giungere a completo rigonfiamento. Permettono la separazione di molecole sferoidali, come le proteine globulari, fino a un peso molecolare di 800.000 dalton e di polimeri a conformazione casuale, come i destrani, fino a un peso molecolare di 200.000 dalton.
I gel di agarosio sono polisaccaridi lineari costituiti da residui alternati di D‑galattosio e di 3,6‑anidro‑L‑Galattosio. Lo stato di gel dipende dalla formazione di legami idrogeno intramolecolari e intermolecolari. Grazie alla loro natura idrofila e all'assenza di gruppi carichi, i gel di destrano e di agarosio hanno uno scarsissimo effetto di denaturazione e di adsorbimento di composti biochimici labili. Dotati di una più larga porosità, i gel di agarosio completano il campo dei gel di destrano. I Gel di agarosio si usano per separare molecole e particelle fino a pesi molecolari di parecchi milioni di dalton e sono pertanto usati nello studio di virus, polisaccaridi e acidi nucleici. I gel di poliacrilamide sono preparati mediante copolimerizzazione di acrilamide e metilenbisacrilamide. Variando le concentrazioni dei due monomeri, si possono ottenere gel a differente porosità. Essi hanno caratteristiche molto simili ai gel di destrano e di agarosio: sono stabili in tamponi acquosi tra pH 1 e 10. e possiedono analoghi coefficienti di rigonfiamento. Inoltre presentano limiti di esclusione compresi tra 1800 e 100.000 dalton.
Nella tabella sono riportati alcuni gel di uso comune. E da ricordare che i gel tipo Sephadex e quelli di poliacrilamide devono essere rigonfiati prima dell'uso, mentre i Sephacryl e i gel d'agarosio sono forniti in una forma già rigonfiata. Inoltre molti gel sono disponibili in una vasta gamma di dimensioni: superfine, fine, medio e a grana grossa.
Maggiori sono le dimensioni delle particelle del gel e maggiore è anche la velocità di flusso della colonna, mentre è minore il grado di risoluzione. Pertanto è preferibile usare particelle molto piccole per scopi analitici e gel a grana grossa per scopi preparativi. La capacità di un determinato gel rappresenta una misura della quantità in peso di un soluto per peso di gel che può penetrare in quel gel.
2 esempi di applicazioni
PURIFICAZIONE - La principale applicazione della cromatografia a esclusione è la purificazione delle macromolecole biologiche.
determinazione del peso molecolare - I volumi di eluizione delle proteine globulari dipendono dal loro peso molecolare. E stato dimostrato che, in un dato intervallo di peso molecolare, il volume di eluizione è una funzione lineare del logaritmo del peso molecolare.
