Apparecchiatura e metodi per l'elettroforesi su lastra di gel
L'elettroforesi su lastra di gel è preferita a quella più convenzionale con gel tubulari perché possono essere analizzati in contemporanea e nelle stesse condizioni un certo numero di campioni.
L'apparecchiatura prevede:
Un alimentatore. Può lavorare a voltaggio o a corrente costante
Una cella elettroforetica. E' costruita in Perspex
I metodi:
La preparazione Si prepara il gel nello stesso contenitore di vetro (o di Perspex) usato per l'elettroforesi. Nel caso delle lastrine il gel viene fatto polimerizzare tra due lastre di vetro ben pulite, affiancate l'una all'altra, ma separate da elementi spaziatori in plastica. Nell'elettroforesi verticale il gel è tenuto in posizione da entrambe le lastre di vetro , mentre nel sistema orizzontale la lastra superiore deve essere rimossa prima della corsa.
Sia nell'elettroforesi che prevede l'uso di tubi di gel (detta "a disco") sia quella su lastra si usa fare un primo gel detto "Lower gel" o "running gel". Sopra di esso viene posto un "upper gel" o "stacking gel" con caratteristiche diverse.
Lo stacking gel ha il compito di permettere che le proteine del campione comincino la corsa effettiva nel running gel in bande molto compatte aumentando la risoluzione della tecnica.
Per fare si che avvenga questo, lo stacking gel ha una percentuale più bassa di acrilamide (comunemente il contenuto totale è 2-3%) e un pH 2 unità circa più basso del running gel.
Applicazione del campione
Sulle lastrine di gel orizzontale si può applicare un frammento di carta imbevuto di campione ma, più comunemente, tanto nell'elettroforesi orizzontale quanto in quella verticale, i campioni vengono iniettati mediante microsiringa in fessure o pozzetti creati, nel gel, con uno stampo a forma di pettine inserito prima che il gel stesso polimerizzi.
il campione viene solubilizzato, di solito, in un tampone contenente saccarosio o glicerolo al 10-15% in modo di aumentare la densità della soluzione e di assicurarsi che discenda nel pozzetto.
per agevolare l'osservazione dei campioni caricati e seguirne la migrazione elettroforetica spesso si aggiunge al campione un colorante come il blu di bromofenolo.
per separare le proteine in base alla loro massa, al campione si aggiunge duodecilsolfato di sodio (SDS) che denatura in presenza di un agente che riduce i gruppi sulfidrilici come il 2-mercaptoetanolo.
Corsa del campione
Bisogna mantenere il contatto elettrico tra il gel e il tampone nella camera. Questo nell'elettroforesi orizzontale può essere fatto con ponti costituiti da carta da filtro o garza (a meno che il supporto del campione non sia già la carta!). In alternativa si immerge direttamente il gel nel tampone in modo da permettere direttamente il passaggio di corrente attraverso il gel. In un sistema verticale del tipo mostrato sotto infatti il gel viene tenuto tra due lastre di vetro , posto nella vaschetta inferiore con la parte alta in contatto col tampone della vaschetta superiore. Il gel completa il circuito tra gli elettrodi posti nei comparti inferiore e superiore.
