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L'esempio di Gray:
A) Miscela di peptidi ottenuti da digestione con CNBr (taglia dopo le Met)
B) Miscela di peptidi ottenuti da digestione con Clostripaina (taglia dopo le Arg)
L'algoritmo consiste nel determinare il/i residuo/i comune/i a ogni consecutivo passaggio della degradazione di Edman in tutti i set di dati dopo il loro corretto allineamento.
Gray concluse che sarebbe stato possibile sequenziare la ribonucleasi (124 residui) se fosse stato possibile tagliare specificatamente la proteina a livello delle Arg, Lys, Cys, Met, Tyr, His e identificare i primi 10 residui di ogni peptide.
Con l'avvento dei moderni sequenziatori "a fase liquida pulsante" equipaggiati on line con analizzatori di feniltioidantoin derivati (PTH-aa) l'idea originale di Gray può essere applicata.
Qui viene presentata una versione migliorata dell'algoritmo di Gray implementata su personal computer.
Si è ricostruita la sequenza completa dell'inibitore di tripsina da germe di grano (WTI; 71 residui) utilizzando dati derivanti da 3 differenti metodi di idrolisi.
Le 75 nmoli di WTI sono state ridotte con ditiotreitolo e piridiletilate con 4-vinylpiridina.
10 nmoli sono state digerite con l'endoproteasi Lys-C
10 nmoli sono state digerite con l'endoproteasi Asp-N
10 nmoli sono state digerite con Bromuro di cianogeno
I tre metodi di taglio sono stati scelti sulla base della composizione amminoacidica
NOTA: nei dati del set CNBr non è identificabile il PTH-Met
Uso del programma:
1. Si inseriscono i dati provenienti dai successivi passaggi della degradazione di Edman + informazioni addizionali sugli agenti idrolitici + gli aa. attesi ai siti di idrolisi, la loro posizione relativa (-N o -C terminale) nei peptidi prodotti e se i corrispondenti PTH-aa sono identificabili nell'analisi di sequenza della corrispondente miscela + il numero di aa. determinati con un analizzatore di amminoacidi
2. Il computer cercherà il residuo/i residui comune/i a tutti i set nei passaggi consecutivi della degradazione di Edman a cominciare dal primo ciclo. La posizione di partenza indicata è stata 1. Il computer cerca i residui comuni ottenendo le sequenze non ambigue. Quando la sequenza non ambigua si interrompe si cercano le nuove posizioni di partenza per i 3 set.
Nessuna ambiguità è stata trovata in 70 di 71 posizioni. L'unico dubbio riguarda la posizione 66, perché sia la C che la R erano comuni ai 3 sets.
Il dubbio potrebbe essere chiarito con un'analisi al FAB-MS usando 1 delle 3 miscele.
Nel programma possono essere introdotti 3000 PTH attraverso una matrice di variabili intere a 3 dimensioni e analizzati simultaneamente dall'algoritmo.