Articolo originale in pdf
1. Analisi di seq. su peptidi individuali:
La proteina in questione (la WTI) viene ridotta ed alchilata e digerita con proteasi V8. I frammenti vengono isolati e sequenziati.
2. Analisi di sequenza su una miscela peptidica:
La proteina in questione viene ridotta ed alchilata e digerita con CNBr. La miscela viene quindi sequenziata.
L'algoritmo deve ora allineare i peptidi sequenziati basandosi sul sequenziamento della miscela.
NOTA: dovrebbero essere preferiti metodi di "taglio" che producono larghi frammenti :
per
limitare le analisi di sequenza dei peptidi individuali
per facilitare l'interpretazione dei dati di un'analisi di sequenza su una
miscela peptidica
Dati da inserire nel programma:
 |
quelli dalla Analisi di seq. sui peptidi individuali |
|
|
quelli dalla Analisi di sequenza sulla miscela peptidica |
|
|
informazioni sugli agenti idrolitici utilizzati: gli amminoacidi che ci si aspetta siano presenti nei siti di taglio e la loro posizione nei peptidi prodotti (N- o C- terminale) |
|
|
informazioni sulla identificabilità o meno dei PTH-derivati nell'analisi di sequenza della miscela (es. PTH-Met non è identificabile a causa della formazione di omoserina e omoserina lattone; il tempo di ritenzione della PTH-omoserina è infatti molto simile a quello del PTH-Thr. |
Cosa fa l'algoritmo:
- stabilisce se i singoli peptidi da digestione con
proteasi V8 hanno siti potenziali di idrolisi per l'altro agente idrolitico
usato, CNBr.
- calcola tutte le possibilità di taglio corrispondenti tenendo in considerazione che possa anche non esservi nessun taglio. => l'algoritmo non dipende perciò dall'efficienza dell'agente idrolitico.
- per tutte le sequenze ricavate in questo modo comincia la ricerca nei dati della sequenza su miscela. NOTA: la metionina non la troverebbe mai a causa della formazione di omoserina e perciò assume che possa essere presente in qualsiasi passo di Edman.
Per ogni sequenza cercata ..
se viene trovata completa -> vengono salvati i passi di inizio e fine corrispondenti -> si passa alla sequenza successiva
se viene trovata incompleta -> si passa alla sequenza successiva ripartendo dal primo passo.
L'allineamento dei peptidi (del punto 1) risulterà ovvio guardando ai loro passi di Edman iniziali e finali e la via seguita per identificarli.
