L'analizzatore di amminoacidi

 

E' un apparecchio completamente automatizzato che permette di determinare la composizione amminoacidica di una proteina, permette cioè di sapere da quanti e quali amminoacidi è costituita quella proteina.

I passaggi fondamentali in una analisi di composizione amminoacidica di una proteina sono:

Idrolisi

L'idrolisi di una proteina può essere condotta in fase liquida o in fase gassosa.

Nel primo caso, la proteina viene ripresa in HCl 6N all'interno di una fiala in cui viene fatto il vuoto in atmosfera di azoto. La fiala viene quindi messa in stufa a 110°C per un tempo variabile compreso tra 24-72 ore.

Nel caso in cui si voglia invece condurre l'idrolisi in fase gassosa, la proteina viene essicata in una fialetta che viene posta all'interno di una fiala più grande munita di un tappo a tre vie con il quale è possibile fare il vuoto in atmosfera di azoto. Sul fondo di questa provetta viene posto l'HCl 6N: l'acido quindi non viene a diretto contatto con il campione proteico che viene idrolizzato in vapori di HCl.

Nelle condizioni in cui viene condotta l'idrolisi delle proteine, tuttavia, alcuni amminoacidi come serina, treonina e tirosina vengono parzialmente distrutti. Mediamente si registra una perdita del 10% per la serina e una perdita del 5% per treonina e tirosina quando si effettua l'idrolisi per 24 h. Altri amminoacidi: la cisteina, la cistina, il triptofano, l'asparagina e la glutammina, vengono addirittura distrutti completamente. Per il dosaggio di questi amminoacidi occorre, quindi, utilizzare alcuni accorgimenti.

Serina, treonina e tirosina: si preparano tre campioni uguali di proteina su cui si opera l'idrolisi a tempi differenti: 24, 48 e 72 ore. Su ciascun campione si dosano questi tre amminoacidi, quindi si costruisce un grafico in cui si riportano in ascissa i diversi tempi di idrolisi ed in ordinata la corrispondente concentrazione di ciascun amminoacido. La retta che si ottiene viene estrapolata al tempo 0 per ottenere la concentrazione reale di ciascuno di questi amminoacidi.

Cisteina, cistina: vengono identificate come S-carbossimetilcisteina. Per poter fare questo tipo di dosaggio occorre ridurre e carbossimetilare la proteina prima di sottoporla ad idrolisi. Questo procedimento prevede dapprima il trattamento della proteina con un agente riducente (ditiotreitolo) in grado di ridurre i ponti disolfuro presenti nella proteina, e il successivo trattamento con ICH2COOH, un reattivo capace di reagire con i residui di cisteina trasformandoli in S-carbossimetilcisteina.

  RCH2SH + ICH2COOH    ------>  RCH2SCH2COOH + HI

L'S-carbossimetilcisteina a differenza della cisteina e della cistina è resistente alle condizioni di idrolisi e può essere facilmente dosata.

In alternativa a questo metodo si può trattare il campione proteico con acido performico, che converte tutti i residui di cisteina e di cistina in acido cisteico.

Triptofano: si può condurre l'idrolisi non in HCl, ma in acido p toluen sulfonico 3M contenente lo 0.2% di triptamina.

Asparagina e Glutamina: in ambiente acido vengono deaminate e vengono quindi dosate insieme ai corrispondenti acidi (acido aspartico e acido glutammico).

Bisogna inoltre tener conto che vi sono alcuni legami peptidici che sono particolarmente resistenti all'idrolisi: è questo il caso di legami in cui sono interessati residui idrofobici (Ile-Val Val-Val etc). Questi legami non vengono completamente idrolizzati nelle 24 h, quindi per un dosaggio accurato degli amminoacidi idrofobici si può prolungare l'idrolisi per 48 o 72 h.

Separazione e quantificazione degli amminoacidi presenti nell'idrolizzato

Un analizzatore di amminoacidi esegue sia la separazione cromatografica degli amminoacidi sia la loro quantificazione.

Gli amminoacidi liberi presenti nell'idrolizzato devono essere derivatizzati con reagenti opportuni che ne permettano il riconoscimento. La derivatizzazione può essere condotta in due modi differenti:

a)  derivatizzazione post colonna
b)  derivatizzazione pre colonna
 

a) Gli amminoacidi presenti nell'idrolizzato vengono separati su una colonna a scambio ionico. I tipi di resina solitamente utilizzati sono scambiatori cationici forti costituiti da polistireni solfonati. Gli amminoacidi vengono solubilizzati in un tampone a pH 2 e la colonna cromatografica viene equilibrata con un tampone allo stesso pH, in modo che tutti gli amminoacidi si trovino ad un valore di pH inferiore al loro punto isoelettrico e siano quindi carichi positivamente. In queste condizioni tutti gli amminoacidi si legano alla resina. L'eluizione viene condotta in gradiente aumentando sia la forza ionica che il pH. In questo modo vengono eluiti prima gli amminoacidi acidi, quindi gli amminoacidi neutri ed infine quelli basici. Gli amminoacidi eluiti dalla colonna passano in un coil di reazione in cui vengono miscelati a 100°C con la ninidrina che reagisce sia con gli amminoacidi primari che quelli secondari formando due diversi tipi di cromofori, che possono essere rilevati rispettivamente a 570 e 440 nm. L'assorbanza di ciascun picco è proporzionale alla concentrazione dell'amminoacido.

Un altro reattivo che può essere utilizzato per questo tipo di analisi è l'o-ftalaldeide (OPA), la quale in presenza di β mercaptoetanolo, a pH 9, reagisce con gli amminoacidi primari formando dei derivati fluorescenti. Prolina ed idrossiprolina non sono in grado di reagire con l'OPA. Anche la cisteina reagisce debolmente con l'OPA, mentre il suo prodotto di ossidazione (l'acido cisteico) dà un composto fortemente fluorescente. I vantaggi di questo reattivo rispetto alla ninidrina sono rappresentati dall'elevata sensibilità (10-100 pmoli) e dal fatto che il prodotto fluorescente si forma a temperatura ambiente in breve tempo (2 min).

b) In questo caso, dopo aver idrolizzato la proteina, gli amminoacidi vengono derivatizzati con un reagente opportuno, quindi vengono separati in HPLC con una colonna in fase inversa.

I reagenti che possono essere utilizzati sono:

La derivatizzazione con l'OPA (che non reagisce con gli amminoacidi secondari) può essere associata alla derivatizzazione con il FMOC. I derivati possono essere rilevati a due diverse l utilizzando un diode-array come sistema di rivelazione.

Anche in questo caso esistono apparecchi che permettono la completa automatizzazione di tutta la procedura.
La determinazione del contenuto in amminoacidi di una proteina è importante per gli studi riguardanti le relazioni tra struttura e funzione delle proteine, tuttavia anche il dosaggio qualitativo e quantitativo degli amminoacidi presenti nei liquidi fisiologici riveste una notevole importanza sia dal punto di vista biochimico che clinico, in quanto può essere di aiuto nella diagnosi di alcuni tipi di malattie.