L'analisi della sequenza di un DNA
Il metodo di Sanger (anche detto metodo didesossi o a interruzione di catena)
- si utilizza l'incorporazione di basi didesossi nella reazione di polimerizzazione del DNA
- porta alla terminazione dell'estensione del primer (un metodo pionieristico di Fred Sanger)
Il metodo base fa uso di:
un primer radioattivo da inserire alla regione di DNA che vogliamo sequenziare. IL DNA stampo deve essere prodotto in un gran numero di copie e deve essere in forma di singola elica. Per far questo il DNA viene clonato nel batteriofago M13, che possiede un DNA a filemento singolo.
il primer viene esteso nella maniera tradizionale (cioè con la DNA polimerasi e i 4 dNTP)Uno o tutti i dNTP vengono marcati con 32P o 35S.
una piccola concentrazione di basi didesossi (dd) vengono inclusi nella miscela di reazione
solitamente questo viene fatto con 4 reazioni separate, in ognuna delle quali viene aggiunto un diverso ddNTP.
così in ogni provetta ci sarà un primer, un DNA stampo, la DNA polimerasi, i 4 dNTP. In aggiunta nella provetta 1 ci sarà una certa quantità di ddATP, nella 2 ddTTP, nella 3 ddGTP, nella 4 ddCTP.
Durante la reazione, i normali dNTP sono incorporati nella catena nascente
casualmente però verrà incorporata una base dd durante la polimerizzazione
quando questo accade la catena non può più espandersi (la base didesossi infatti manca dell'ossidrile in 3').
Il risultato sarà allora quello di avere per ogni provetta un gran numero di frammenti ognuno di diversa lunghezza che termina con la rispettiva base didesossi.
se ora i frammenti della provette vengono fatti correre su un gel urea 8M/acrilamide 20% a 70°C (per evitare la rinaturazione del DNA che modificherebbe la velocità di migrazione) , essi si separeranno secondo la grandezza
chiaramente ci si aspetta che il frammento più corto osservabile sia il primer.
il pattern che ne deriva facendo correre il contenuto di ogni provetta in corsie diverse ci permette di risalire alla sequenza del DNA stampo.
attualmente si usano sequenziatori automatici che fanno uso di coloranti specifici che etichettano ciascuna base didesossi.
Questi coloranti vengono letti da un laser e la sequenza ricostruita facilmente al computer.
Il vantaggio sta anche nel fatto che i frammenti possono essere così letti quando vengono eluiti senza dover fermare la corsa del gel.
Inoltre, dal momento che ogni base dd può essere inequivocabilmente identificata, tutte le 4 reazioni di terminazione della catena con le 4 basi dd possono essere fatte in una singola provetta e fatte correre su una corsia.
i sequenziatori automatici possono così leggere più a lungo che non utilizzando un metodo manuale.
molti più campioni insieme possono essere analizzati aumentando la resa
i gel di acrilamide utillizzati per l'analisi di sequenza sono tipicamente lunghi dai 50 ai 100 cm
col sequenziamento manuale si possono risolvere sequenze continue di 400 basi. Il sequenziatore automatico è capace di dare invece il doppio dell' informazione (400-700 basi)
Sul doppio filamento di DNA da analizzare, un frammento di circa 250-300 basi, bisogna procedere con la marcatura radioisotopica per via enzimatica delle estremità 5' o 3'.
le due catene devono quindi essere separate e si fa quindi una elettroforesi su gel di poliacrilamide in condizioni denaturanti. Le catene verranno analizzate separatamente.
il DNA marcato a singola elica viene a questo punto diviso in 4 aliquote.
In ognuna delle 4 provette diverse il DNA verrà sottoposto a un trattamento che andrà a modificare specificatamente un tipo di base (in alcuni casi, due tipi di basi) mediante metilazione o rimozione della stessa. Le condizioni di reazione sono tali che in media per una molecola di DNA viene operata una sola modificazione.
Successivamente i campioni vengono trattati con piperidina per scindere il legame fosfodiesterico coinvolto nella modificazione.
l'analisi dei prodotti avverrà come descritto per il metodo di Sanger.
Rispetto al metodo di Sanger i nucleotidi sono marcati solo ad una estremità. Questo significa che servirà un maggior quantitativo di DNA per rilevarlo correttamente (almeno 5 volte di più).