Cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC)
Il potere di risoluzione di una colonna cromatografica aumenta all'aumentare della lunghezza della colonna stessa e del numero di piatti teorici presenti per unità di lunghezza, quantunque esistano dei limiti alla lunghezza di una colonna dovuti al problema dell'allargamento dei picchi. Poiché il numero dei piatti teorici è in relazione all'area della fase stazionaria, ne consegue che a minori dimensioni delle particelle della fase stazionaria corrispondono migliori risoluzioni. Sfortunatamente in questo caso aumenta anche la resistenza al flusso dell'eluente. Tutte le forme di cromatografia discusse finora si affidano a un'eluizione per gravità o mediante sistemi di pompaggio a bassa pressione dell'eluente. Con tali metodi si ottengono quindi velocità di flusso relativamente basse che favoriscono il fenomeno dell'allargamento dei picchi per semplice diffusione dei soluti. Non è possibile applicare velocità di flusso più elevate perché ciò provocherebbe un ritorno di pressione sufficiente a danneggiare la struttura della matrice della fase stazionaria con conseguente riduzione del flusso dell'eluente e peggioramento della risoluzione. Questa evoluzione tecnologica, che ha coinvolto la cromatografia d"adsorbimento, di ripartizione, a scambio ionico, ad esclusione e di affinità, ha incrementato di molto il grado di risoluzione e la velocità di separazione il che spiega perché l'HPLC sia considerata oggi la tecnica cromatografica più diffusa, efficace e versatile.
Apparato e Materiali
Le colonne per HPLC sono generalmente di acciaio inossidabile e sono capaci di sopportare alte pressioni. Di solito si usano colonne rettilinee lunghe 20-50 cm e con un diametro di 1-4 mm, anche se attualmente sono disponibili colonne capillari di diametro inferiore. Le migliori colonne sono calibrate ad alta pressione e con una rifinitura interna a specchio che consente un'efficiente impaccatura. Alle due estremità della colonna esistono setti perforati di acciaio inossidabile, o di teflon, che servono a trattenere il materiale in essa contenuto. I setti detono essere omogenei per consentire un flusso uniforme di solvente.
Tutti i materiali di supporto per HPLC sono caratterizzati da una struttura regolarmente sferica che li contraddistingue dai materiali convenzionali. Queste piccole sferette s'impaccano più efficientemente e offrono buone proprietà di flusso.
Tutti i solventi usati per HPLC devono essere particolarmente puri, poiché anche tracce di contaminanti alterano le caratteristiche della colonna e interferiscono con il sistema di rivelazione, in particolare quando si misura l'assorbanza al di sotto dei 200 nm. In commercio esistono solventi particolarmente puri per HPLC, ma anche in questo caso è opportuno inserire, prima della pompa, un microfiltro da 1-5 mm. È inoltre molto importante che tutti i solventi siano degassati prima dell'uso, per evitare la formazione di bolle di gas nelle pompe. Il solvente viene degassato mediante riscaldamento, agitazione vigorosa con agitatore magnetico, o sottovuoto, con ultrasuoni o facendo gorgogliare elio nel recipiente che lo contiene.
Il sistema di rivelazione:Poiché la quantità di campione applicato alla colonna è molto piccola, è essenziale che sia elevata e stabile la sensibilità del sistema di rivelazione. Questo è solitamente costituito da tino spettrofotometro a lunghezza d'onda variabile nel visibile e nell'ultravioletto, da un fluorimetro, da un misuratore dell'indice di rifrazione o da un rivelatore elettrochimico. Attualmente, inoltre, esistono apparati per HPLC connessi a spettrometri di massa.
La procedura
In teoria il campione dovrebbe essere introdotto nella colonna sotto forma di banda estremamente sottile. A questo scopo esistono due metodi principali: il primo utilizza una microsiringa in grado di sostenere pressioni elevate. Il campione è iniettato, attraverso un foro d'iniezione, direttamente in colonna o in uno strato di materiale inerte immediatamente precedente la colonna. Questa operazione può essere compiuta mentre il sistema è sotto alta pressione, oppure si spegne la pompa prima dell'iniezione e quando la pressione è scesa al valore di quella atmosferica si inietta il campione e si riaccende la pompa. Quest'ultimo metodo viene chiamato iniezione a flusso interrotto. Il secondo metodo di introduzione del campione utilizza un iniettore a spirale, costituito da un occhiello metallico inserito lungo il capillare che alimenta la colonna. In esso viene introdotto il campione quindi, tramite una valvola, l'eluente viene incanalato nell'occhiello e così il campione si trova a essere spinto in colonna dall'eluente stesso, senza che s'interrompa il flusso di solvente. Dopo ripetute applicazioni di campioni complessi quali siero, urina, plasma o sangue intero deproteinizzato, la colonna può perdere il suo potere risolutivo. Per prevenire questa eventualità viene installata una precolonna tra l'iniettore e la colonna vera e propria.
Applicazioni
L'HPLC di ripartizione in fase inversa è particolarmente utile nelle separazioni di composti polari quali farmaci e loro metaboliti, peptidi, vitamine, polifenoli e steroidi.
L'HPLC ha trovato probabilmente il suo impiego più significativo nella separazione di oligopeptidi e proteine. Il sistema adibito alla separazione di molecole proteiche prende il nome di cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC). Alla base della tecnica di FPLC non è presente un unico principio, poiché in essa coesistono la cromatografia in fase inversa, quella a scambio ionico e la cromatofocalizzazione. Sebbene la cromatografia ad alta risoluzione mediante lo scambio ionico o l'esclusione molecolare si presti bene alla separazione di molecole proteiche, non tutte le proteine possono essere purificate completamente mediante l'FPLC. In questi casi può essere d'aiuto la cromatografia a interazioni idrofobiche, che sfrutta le zone di alta idrofobicità presenti sulla superficie delle proteine. La fase stazionaria è fortemente idrofobica e generalmente costituita da ottil- o fenilagarosio.