La purificazione tramite cromatografia d'affinità, a differenza degli altri tipi di cromatografia, dell'elettroforesi e della centrifugazione, non si basa sulle differenze nelle proprietà fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le interazioni altamente specifiche delle molecole biologiche.
E' in grado, pertanto, almeno in teoria, di raggiungere una purificazione completa in una singola tappa, anche partendo da miscele complesse.
Questa tecnica è stata sviluppata inizialmente per la purificazione degli enzimi, ma, in seguito, è stata anche applicata ai nucleotidi agli acidi nucleici, alle immunoglobuline, ai recettori di membrana e, persino, a cellule o a frazioni subcellulari.
La tecnica prevede che il composto da purificare si leghi reversibilmente a un ligando specifico, immobilizzato su una matrice insolubile:
Il metodo necessita, dunque, di una dettagliata conoscenza della struttura e delle specificità del composto da purificare, in modo da poter allestire accuratamente le condizioni di separazione che diano la resa più elevata. Nel caso di un enzima, il ligando può essere rappresentato dal substrato, da un inibitore reversibile o da un attivatore.
I tipi di resina usati e il metodo di "attacco" del componente da separare possono variare, così come il metodo di eluizione.
una generalizzazione che si può fare riguardo il metodo di eluizione è che il componente da separare deve essere "spiazzato" dal gruppo funzionale della colonna mettendo nel buffer di eluizione un'alta concentrazione del gruppo funzionale libero.
altri metodi di eluizione includono il cambiamento delle condizioni del buffer in modo tale che la proteina modifichi il proprio stato nativo. Questo può essere raggiunto modificando il pH o aggiungendo un agente denaturante come l'urea o la guanidina.
Materiali
La matrice ideale per cromatografia d'affinità deve possedere le seguenti caratteristiche:
1. Deve contenere gruppi reattivi numerosi e adatti a legare covalentemente il ligando.
2. Deve essere stabile nelle condizioni d'interazione con la macromolecola e nella successiva eluizione.
3. Non deve interagire, se non debolmente, con altre macromolecole.
4. Deve possedere buone capacità di flusso.
le matrici insolubili impiegate
cellulosa polimero del glucosio (D) con legami b (1->4)
Destrano (Sephadex) polimero del glucosio (D) con legami a (1->6)
Agarosio (Sepharose e Biogel A) polimero del galattosio con legami b (1->4) D galattosil b (1->4) 3.6 anidro L-galattosio
Poliacrilammide copolimero della
acrilammide 
e
della bisacrilammide
Vetro poroso preparato per riscaldamento del sodio borosilicato a 700-800 °C. Le fasi borato e silicato si separano e per trattamento con acidi si ottiene la fase silicica in forma porosa.