Esperienza di laboratorio

Scopo: misurare la K_m e la V_max per l'enzima fenolo-ossidasi.

Strumenti necessari:

lo spettrofotometro
le micropipette
una soluzione contenente il substrato	le soluzioni hanno le seguenti concentrazioni da me scelte:
	20	mM
	2	mM
	0.2	mM
una soluzione contenente l'enzima
le cuvette da inserire nello spettrofotometro

Devo fare una serie di saggi.

Scelgo la concentrazione di substrato. Parto da 5 mM.

Devo sapere:

Quant'è il volume di enzima da mettere nella cuvetta? Il volume è fisso: 10 ml di enzima

Quant'è il volume di substrato V_cda mettere nella cuvetta? Il volume lo ricavo sapendo...

	la concentrazione della soluzione contenente il substrato [S]_A (20 mM),
	la concentrazione di substrato finale da mettere nella cuvetta [S]_B (5 mM),
	il volume finale che deve raggiungere la cuvetta V_f (1 ml).

Facendo 5mM · 1ml = 5mmoli, la quantità di substrato da mettere nella cuvetta.

Il volume da prelevare dalla soluzione sarà quindi 5mmoli/20mM =0.25 ml

Ovvero X : 5mmoli = 1ml : 20mM

Quant'è il volume di soluzione tampone?

1ml

0.25 ml

0.01 ml

0.74 ml

(volume della cuvetta)

(volume di substrato)

(volume di enzima)

volume di soluz.tampone

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Preparata la cuvetta e miscelato il contenuto, lo spettrofotometro ci darà la DA/min.

Adesso posso ricavare le U.I./ml. da questa equazione:

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I saggi effettuati sono stati i seguenti:

il grafico evidenzia la necessità di scartare il saggio nº4

, probabilmente anche il saggio nº6, i nº2 e 3 perché

non si trovano nella zona di iperbole che ci interessa

il grafico evidenzia la necessità di scartare il saggio nº4

e n°10, ricordando che i punti a basso valore sull'asse delle

ordinate hanno l'errore maggiore

il grafico evidenzia la necessità di scartare il saggio nº4

Adesso facciamo gli stessi grafici utilizzando solo i dati che abbiamo ritenuto più validi.

n.	[S]		v=U.I/ml	[S]/v	utilizzazione
1.	5.000	mM	0.675	7.407	NO	si trova nella porzione di curva che non mi interessa	Ð
2.	0.500	mM	0.820	0.617	valore alto	lo prendo in considerazione per la regressione non lineare al computer, ma non per i grafici finali	-
3.	5.000	mM	0.753	6.640	NO	si trova nella porzione di curva che non mi interessa	Ð
4.	0.500	mM	0.517	0.967	NO	ritenuto non buono dai grafici precedenti	Ð
5.	0.500	mM	0.804	0.617	valore alto	lo prendo in considerazione per la regressione non lineare al computer, ma non per i grafici finali	-
6.	0.100	mM	0.634	0.157	NO	ritenuto non buono dai grafici precedenti	Ð
7.	0.010	mM	0.486	0.02	SI		P
8.	0.020	mM	0.570	0.035	SI		P
9.	0.040	mM	0.700	0.057	SI		P
10.	0.050	mM	1.110	0.045	NO	ritenuto non buono dai grafici precedenti	Ð
11.	0.030	mM	0.671	0.045	SI		P
12.	0.005	mM	0.140	0.0357	SI		P
13.	0.003	mM	0.110	0.027	SI		P
14.	0.002	mM	0.089	0.022	SI		P
15.	0.004	mM	0.167	0.024	SI		P