Il glucosio viene prima fosforilato dalla adenosina trifosfato (ATP) nella reazione catalizzata dalla esochinasi (HK).
Il glucosio-6-fosfato (G-6-P) formato viene quindi ossidato a 6-fosfogluconato (6-GP) in presenza di NAD. Questa reazione è catalizzata dalla glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G-6-PDH). Durante questa ossidazione, un quantitativo equimolare di NAD viene ridotto a NADH. Il conseguente aumento di assorbanza a 340 nm è direttamente proporzionale alla concentrazione di glucosio.
Il reagente per il glucosio, quando ricostituito in accordo alle istruzioni, contiene approssimativamente le seguenti concentrazioni di ingredienti attivi.
| NAD | 1.5 mmol/L |
| ATP | 1.0 mmol/L |
| esochinasi (di lievito) | 1000 unità/L |
| G-6-PDH (L.m.) | 1000 unità/L |
| Ioni Magnesio | 2.1 mmol/L |
| Tampone | pH 7.5 ± 0.1 |
| Stabilizzatori non reattivi e "riempitivi" | |
| Sodio azide, 0.05%, come preservante |
Precauzioni:
Il reagente per il glucosio è per "l'uso diagnostico in vitro". La sodio azide contenuta può reagire con piombo e rame a formare metalli altamente esplosivi. Come da disposizione, sciacquare con un gran volume d'acqua per prevenire l'accumulo di azide. la sodio azide è anche tossica. Attenzione andrebbe usata anche per evitare un eventuale ingestione.
La preparazione:
Ricostituire il reagente col volume di acqua deionizzata indicata.
Mantenimento e stabilità:
Il reagente non idratato va conservato in frigorifero (2-6ºC). Il reagente è stabile fino alla data indicata sull'etichetta.
Il reagente ricostituito è stabile per 7 giorni a temperatura ambiente (18-26ºC) e per 4 settimane in frigorifero (2-6ºC).
Deterioramento:
Il reagente non è più utilizzabile se la sua assorbanza a 340 nm con acqua come riferimento è maggiore di 350 nm => si è prodotto NADH spontaneamente. Gettare via la fiala se il reagente non idratato mostra agglomerati dovuti a possibile penetrazione di umidità, se non si dissolve completamente dopo ricostituzione o se la soluzione appare torbida.
Raccolta del campione e preparazione:
Il sangue raccolto senza anticoagulanti dovrebbe essere centrifugato prontamente dopo la formazione di coaguli, dal momento che i globuli rossi metabolizzano glucosio. Approssimativamente il 5% del contenuto del glucosio sarà consumato dalla glicolisi per ogni ora che il siero resta con i coaguli. I livelli di glucosio nel siero sono stabili per almeno 48 ore a temperatura ambiente. Se il plasma deve essere utilizzato, il sangue deve essere raccolto in provette contenenti anticoagulante e fluoruro di sodio per minimizzare la glicolisi. Il fluoruro di sodio può essere omesso se il plasma è separato dalle cellule entro 30 minuti dopo la raccolta.
Sostanze interferenti:
Campioni torbidi e estremamente emolizzati ed itterici possono dare valori falsi molto alti. Si raccomanda di usare un bianco con questi campioni. La procedura descritta non discrimina tra glucosio e glucosio-6-fosfato. Alcune droghe e altre sostanze possono influenzare i valori di glucosio.
Materiale richiesto:
Il reagente.
Lo spettrofotometro capace di
misurare accuratamente l'assorbanza a 340 nm.
Le cuvette con proprietà ottiche adatte alla misurazione a 340 nm.
Micropipette per il trasferimento accurato di volumi richiesti per il saggio.
Un timer.
Acqua a temperatura costante se il saggio deve avvenire ad una temperatura diversa da quella dell'ambiente.
Procedura:
-
Preparare il reagente come da istruzioni allegate.
-
Settare la lunghezza d'onda dello spettrofotometro a 340 nm e l'assorbanza a zero usando l'acqua come riferimento.
-
Riscaldare il reagente alla temperatura indicata per il saggio.
-
Preparare una serie di cuvette o provette per il bianco e i campioni.
-
Pipettare 1,5 ml di reagente in ogni provetta.
-
Aggiungere 0.01 ml (10 mL) di acqua deionizzata alla cuvetta del bianco. Aggiungere 0.01 ml di campione in una provetta. NOTA: il rapporto campione:reagente è di 1:150.
-
Incubare le provette per 5 minuti alla temperatura del saggio.
-
Leggi e registra l'assorbanza (A) del bianco e del campione a 340 nm usando acqua come riferimento. NOTA: Dopo che la reazione è completata, l'assorbanza resta costante per un ora.
-
Per determinare la concentrazione di glucosio (mg/dL) di campione, fai riferimento alla sezione calcoli.
Procedura alternativa:
Pipettare 1 mL di reagente e miscelarlo con 0.01 mL (10 mL) di campione. NOTA: il rapporto campione:reagente è di 1:100. seguire le procedure elencate prima. I volumi di reagente e campione possono essere alterati proporzionalmente per adattarsi allo spettrofotometro disponibile nel laboratorio.
Procedura di utilizzo del bianco:
Campioni torbidi e estremamente emolizzati ed itterici possono dare valori falsi molto alti. Per evitare questo, si raccomanda di usare un bianco. Questo può essere preparato aggiungendo 0.01 mL di campione in una soluzione salina al posto del reagente. L'assorbanza di questa miscela letta usando acqua come riferimento a 340 nm viene quindi sottratta dal DA prima di calcolare la concentrazione di glucosio.
Calibrazione:
La concentrazione di glucosio può essere calcolata basandosi sul coefficiente di estinzione molare del NADH (6.22 a 340 nm).
Il fattore moltiplicativo:
la concentrazione di glucosio
(mg/dL)= 
dove:
DA = variazione di assorbanza a 340 nm
VT= volume totale
PM= peso molecolare del glucosio (180.16)
100= converte i millilitri in decilitri
6.22= è il coefficiente di estinzione molare del NADH
CO= è il cammino ottico del raggio di luce
VC= è il volume del campione
1000= converte i microgrammi in milligrammi.
