2^a esperienza di laboratorio

Saggiamo un enzima in presenza di un inibitore reversibile.

mantenendo costante la quantità di catalizzatore e le condizioni di saggio.

Sono state eseguite tre curve di attività/substrato, ciascuna in presenza di una certa concentrazione fissa e nota di inibitore.

I dati sperimentali sono i seguenti:

da questi dati:

utilizziamo a questo scopo  i grafici : diretto, doppi reciproci, Hanes

I grafici diretti per le tre concentrazioni di inibitore:

I doppi reciproci:

Hanes:

Dai grafici dei doppi reciproci ho ricavato le V_max e  le K_M apparenti.

Quello che osservo è che all'aumentare di [ I ]  la V_max ^app non cambia, mentre la K_M ^app aumenta, siamo quindi in presenza di un inibitore competitivo.  V_max^app=V_max

Per calcolare adesso la K_M e la K_I   dell'enzima,

facciamo un grafico secondario K_M ^app/[ I ].

Ingrandiamo l'intercetta sull'asse delle y per leggere il valore della K_M e della K_I sull'asse delle x.

I valori ottenuti sono K_M = 10 mM e  K_I = 1,1 mM

Lo stesso enzima è stato poi saggiato, nelle stesse condizioni sperimentali, con altri due inibitori reversibili.

I dati sperimentali sono i seguenti:

Anche in questo caso identifichiamo i tipi di inibitore e calcoliamo le costanti di inibizione.

Con l'inibitore 2:

Ingrandiamo il grafico dei doppi reciproci nei punti di intersezione.

La V_max ^app=1/0.22=4.54  U.I/ml  e  la   K_M ^app=1/0.9=1.11  mM per l'inibitore 2

Dal momento che sono diminuite entrambe, l'inibitore 2 è di tipo acompetitivo.

Con l'inibitore 3:

Ingrandiamo il grafico dei doppi reciproci nei punti di intersezione.

La V_max ^app=1/5=0.2 U.I/ml    e  la   K_M ^app=1/0.1=10 mM per l'inibitore 3

Dal momento che solo la V_max è diminuita,

l'inibitore 3 è di tipo non-competitivo.

Tenendo presente che la K_M = 10 mM e la  V_max = 47 U.I/ml

Calcolo la K_I per l'inibitore 2:

               K_I=1.06

Calcolo la K_I per l'inibitore 3:

            K_I=0.025