Nel
1949, si era osservato che il meristema apicale di una pianta
infettata da
un virus (cioé la piccola massa di cellule indifferenziate, con una
dimensione
inferiore al decimo di millimetro, situata all'estremità dello stelo o del
fusto, che cresce costantemente ed origina gli organi della pianta) era, quasi
indenne. Anche i semi prodotti da una pianta infetta erano molto spesso sani.
Il
meristema si moltiplica per originare una piccola pianta che porta 5-6
foglie; dopo alcune settimane, lo stelo viene diviso in 5 o 6 microtalee che,
in condizioni favorevoli, si trasformano in piante complete.
I vantaggi sono
notevoli: un meristema di lampone può produrre anche 50.000 discendenti per
mezzo della coltura in vitro, quando le tecniche classiche di propagazione
ne forniscono soltanto 50 per anno; Un altro vantaggio della coltura in
vitro dei meristemi è l'ottenimento di piantine, in particolare nelle piante
annuali.
Il
rischio più grave di questa tecnica di propagazione vegetativa è quello
della diminuzione della variabilità
genetica;
È
dunque necessario, oltre al perfezionamento delle tecniche di produzione di
massa di alcune specie di piante, creare delle banche di geni per conservare i
patrimoni ereditari indispensabili al mantenimento della variabilità
genetica.
Molte specie di piante coltivate vengono propagate per via agamica
con lo scopo di conservare alcune caratteristiche varietali essenziali, sia
perché sono sterili, sia perché il loro genoma è troppo complesso e quindi
la riproduzione gamica rischia di determinare delle gravi variazioni
fenotipiche. In queste specie appaiono talvolta dei cloni diversi dalle linee
parentali: sono delle varianti somatiche, che provengono da cambiamenti
genetici nelle cellule dei meristemi (modificazione del numero dei cromosomi
nel nucleo, mutazioni a livello di alcuni loti genici, cambiamenti a livello
dei geni extranucleari nei cloroplasti o nei mitocondri). Molte varietà
coltivate derivano da varianti somatiche: il pompelmo rosa, il mandarancio, la
pesca nettarina (o nocepesca) e molte varietà di patata. Nella batata (patata
dolce o patata americana), la frequenza di queste varianti somatiche può
arrivare al 2% e la conservazione della purezza varietale attraverso le
abituali tecniche di propagazione vegetativa è un problema.
Gli sforzi
compiuti dopo la metà degli anni '70 per ottenere la moltiplicazione
vegetativa della palma da olio attraverso le tecniche della coltura in
vitro meritano, per le loro conseguenze sul piano economico una menzione
particolare. In Costa d'Avorio, le piante selezionate dallo Institut de
recherche sur les huiles et les oléagineux (IRHO) producevano più di 4
t/ha/anno di olio contro 1 t/ha/anno delle piante non selezionate; in
Colombia, con piogge meglio distribuite e suoli migliori, la resa poteva
superare le 6 t/ha/anno. Il miglioramento attraverso l'incrocio è una tecnica
che richiede molto tempo, perché si stima che occorrano dieci anni per
giudicare in modo soddisfacente i risultati. I ricercatori si erano quindi
indirizzati verso la moltiplicazione vegetativa degli individui aventi una
produzione elevata. Ma la palma da olio non forma dei polloni naturali, le
foglie non radicano naturalmente e non è possibile prelevare dal suo tronco
dei ramoscelli che potrebbero essere trapiantati. I ricercatori non avevano
altra scelta che di ricorrere alla coltura dei tessuti in
vitro. Né la radicazione in
vitro di piccoli pezzi di fusto con molte gemme, né la coltura di
meristemi era stata possibile nel caso della palma da olio. Era stato allora
necessario decidersi ad ottenere delle masse di tessuto non organizzato, o
callo, in seguito ad una «dedifferenziazione» di tessuti di organi
differenziati, quindi coltivare questi calli fino a quando non giungevano alla
rigenerazione di una plantula completa. I ricercatori della società Unilever
e quelli francesi dell'IRHO e dello ORSTOM (Office de la recherche
scientifique et technique outremer) riuscirono a farlo . La tecnica messa a
punto dai ricercatori
dello IRHO e dello ORSTOM consiste nel prelevare delle foglie giovanissime
alla sommità dell'albero, senza ledere il meristema della gemma apicale
(perché in tal caso l'albero muore). In un primo mezzo di coltura, si formano
nel giro di 90 giorni, i calli partendo dai frammenti delle foglie; dopo il
passaggio su un secondo ed un terzo mezzo di coltura i calli si trasformano in
«embrioidi», che sono molto simili agli embrioni originati dalla
riproduzione sessuale. Gli embrioni si automoltiplicano spontaneamente e
questa moltiplicazione viene favorita in un quarto mezzo di coltura; il numero
di questi embrioni può triplicarsi in un mese, in tal modo una decina di loro
ne producono in un anno più di centomila. Un quinto mezzo di coltura permette
lo sviluppo degli embrioni in plantule complete di foglie, mentre un sesto ed
un settimo mezzo favoriscono la radicazione. Sono necessari tre mesi per
passare dallo stadio di «embrioide» a quello di plantula la cui parte aerea
è alta una dozzina di centimetri. La produzione di plantule che utilizza
questa tecnica di clonazione venne realizzata, all'inizio del 1981, in scala
semi-industriale presso il centro di ricerca di La Mé in Costa d'Avorio.
Concludendo,
milioni di plantule di palma da olio, dalle caratteristiche ben
definite dovrebbero poter essere distribuite nei paesi tropicali interessati.
Nel
1971, Takebe ed i suoi collaboratori erano riusciti ad ottenere dei
protoplasti lisando la membrana di cellule di foglie di tabacco con una cellulasi ed una
pectinasi. I protoplasti venivano coltivati in un mezzo dove
potevano dividersi per dare origine a dei calli, dai quali era possibile
rigenerare una pianta completa. Più del 90% dei cloni ottenuti, chiamati protocloni, presentavano una grande somiglianza con le linee parentali, tanto
sul piano fenotipico che su quello genotipico. I protoplasti, in questo caso
del tabacco, permettevano così di evitare la variabilità che caratterizza le
altre tecniche di produzione dei cloni.
Nel caso della patata non era stato
possibile selezionare, nonostante le attive ricerche condotte fin dal 1905 in
Europa ed in America settentrionale, una coltivar che avesse una resistenza
alla maggior parte delle malattie gravi, una rapida adattabilità a nuove
condizioni biogeografiche, delle caratteristiche agronomiche interessanti, e
soprattutto una eccellente resa. Negli Stati Uniti nel 1980 venivano coltivate
quattro varietà sul 72% della superficie coltivata a patata; la più
caratteristica tra loro era la Russet Burbank. L'origine della varietà Russet
Burbank, che contribuisce a circa il 40% della produzione totale degli Stati
Uniti, risale al 1875, quando il botanico Luther Burbank selezionò una
plantula dalla progenie originata da un frutto di patata. I lavori di Burbank
possono essere tanto più apprezzati se si pensa che, dopo lo inizio degli
anni '30 i selezionatori americani avevano esaminato più di venti milioni di
piante di patata senza riuscire ad isolare una varietà così interessante
come la Russet Burbank.
L'obbiettivo
principale era di aumentare la resistenza della patata agli agenti patogeni.
Nel 1977 Shepard e Totten (in Shepard et
al., 1980) avevano messo a punto delle tecniche di rigenerazione di piante
partendo dai protoplasti delle cellule fogliari della coltivar Russet Burbank.
Shepard et
al. (1980) esaminarono in questo modo più di diecimila protocloni della
coltivar Russet Burbank.
Shepard
(1982) aveva constatato che a differenza dei protocloni del tabacco quelli
della Russet Burbank non erano identici alla linea parentale, né somiglianti
tra loro. In alcuni di questi protocloni, chiamati varianti fenotipiche, le
differenze tra gli individui erano molto piccole ed infatti la maggior parte
dei caratteri della cultivar originale venivano conservati (in particolare
veniva conservato il numero iniziale di 48 cromosomi). Le ricerche di Shepard
e dei suoi collaboratori dimostravano dunque che i cloni ottenuti partendo dai
protoplasti fogliari di patata (Russet Burbank) non erano identici e che le
variazioni fenotipiche ottenute erano la conseguenza di modificazioni genetìche
nelle cellule somatiche, la cui esatta natura era ancora da stabilire.
I
risultati ottenuti in laboratorio potrebbero progressivamente avere delle
applicazioni in condizioni naturali ed allargare il campo delle ricerche
agronomiche. La rigenerazione di piante complete da colture di cellule o da
calli tissutari potrebbe essere estesa ad altre specie importanti come la
manioca, la soia o a delle varietà cerealicole che sono refrattarie ad un
tale sistema di rigenerazione.
La fusione
dei protoplasti permetterebbe di aumentare la possibilità di ottenere ibridi
vegetali. Questa promettente tecnica di ibridazione non segue più la naturale
via sessuale, che aveva permesso di ottenere, con più o meno
difficoltà, degli ibridi tra il frumento e la ségale (triticale), e tra
il cavolo ed il rafano (rafanobrassica).
È
stata realizzata la fusione dei protoplasti di molte specie, generi e famiglie
vegetali e le ricerche riguardano i mezzi per ottenere, dopo la fusione, la
rigenerazione di organismi completi.
Nelle
piante diploidi però è molto raro che una mutazione colpisca i due geni (alleli)
dei due cromosomi omologhi; l'individuo è generalmente eterozigote (i due
geni sono diversi) e si esprime solo il gene dominante e non il recessivo.
negli individui aploidi invece le mutazioni si menifestano immediatamente. Gli individui aploidi sono sterili, ma è
possibile duplicare artificialmente il loro genoma, per esempio con la
colchicina, per ottenere delle piante fertili, diploidi ed omozigoti. La
coltura dei granuli pollinici è divenuta la sorgente principale di piante
aploidi nelle specie ornamentali, orticole, cerealicole o foraggere. I granuli
pollinici potrebbero essere utilizzati, in maniera più semplice dei
protoplasti, nelle esperienze di trasformazione genetica, per ottenere delle
piante con delle caratteristiche particolari.
La coltura
in massa di cellule vegetali era stata messa a punto dopo il 1976 dai
ricercatori giapponesi, che erano riusciti a coltivare la biomassa
corrispondente a 20 metri cubi. L'estrazione delle sostanze utili da questa
biomassa vegetale presuppone la distruzione delle cellule, come nel caso dei
microrganismi, ma sono state eseguite delle ricerche per evitare questa
distruzione, in quanto una determinata massa di cellule vegetali è molto più
difficile da ottenere di una equivalente di batteri o di lieviti. L'immobilizzazione delle cellule vegetali entro dei polimeri sembra la
soluzione più comoda. Le cellule debbono rimanere vive in questi polimeri per
dei periodi di tempo sufficienti affinché lo sfruttamento sia redditizio.
Sembra che siano stati ottenuti dei tempi di sopravvivenza di molte centinaia
di giorni (in Hennequín, Steck e Roncucci, 1982). Ma è necessario anche
poter recuperare facilmente i metaboliti
sintetizzati, perché si accumulano
generalmente nei vacuoli delle cellule,invece di essere escreti nel
mezzo di coltura. Secondo numerosi esperti, questo è il problema essenziale
dell'utilizzazione delle cellule vegetali per la produzione di sostanze utili. Un'altra difficoltà è quella di poter disporre di
quantità sufficienti di materiale vegetale omogeneo e di
ceppi stabili, il
che richiede dei mesi o degli anni a seconda della specie.
La
coltura di cellule di piante tropicali
ancora non molto conosciute biochimicamente, il cui prezioso patrimonio
genetico potrebbe essere conservato in collezioni specializzate,
contribuirebbe alla scoperta di nuove sostanze terapeutiche. Le conoscenze e
l'esperienza già acquisite nel campo dell'immobilizzazione delle cellule
microbiche e dei loro enzimi e sul funzionamento di questi bioreattori
apporteranno senza dubbio un prezioso contributo alla messa a punto di una
tecnologia adatta alla coltura delle cellule vegetali, il cui grande
potenziale di variabilità biologica può essere sfruttato sul piano
biochimico.
Le
ricerche sulla fissazione biologica dell'azoto atmosferico vengono condotte in
molti paesi non solo per migliorare l'efficacia di questo processo essenziale
per:
-
il
funzionamento del ciclo dell'azoto
nella biosfera e per
-
l'incremento
della produttività dei vegetali, ma anche per
-
creare
delle associazioni simbiotiche azotofissatrici oltre quelle esistenti
tra le leguminose ed i batteri del genere Rhizobium.
La creazione di tali associazioni tra microbi azotofissatori e cereali
potrebbe avere delle importanti applicazioni in campo agronomico come, a
più lungo termine, il trasferimento, dai batteri alle piante, dei geni
della fissazione dell'azoto (Evans e Barber, 1977; Elmerich, 1979).
La
migliore conoscenza delle associazioni simbiotiche azotofissatrici ha avuto
come conseguenza di rendere più efficace la manipolazione e l'utilizzazione
degli inoculi delle leguminose, mentre la conoscenza dei meccanismi di
regolazione della nitrogenasi ha migliorato l'impiego dei fertilizzanti
(concimi azotati e solforati, molibdeno). Questi progressi, che sono una prova
della efficacia della ricerca interdisciplinare, fanno intravedere anche delle
promettenti prospettive per l'applicazione in agricoltura dei risultati delle
ricerche di base attesi nei seguenti campi:
-
Sfruttamento delle possibilità offerte dalle associazioni simbiotiche
azotofissatrici formate con leguminose tropicali e con specie arbustive non
leguminose;
-
Aumento dell'efficacia della fissazione e dell'assimilazione dell'azoto,
agendo sui meccanismi genetici di regolazione del processo;
-
Elaborazione di nuovi sistemi azotofissatori, ottenendo degli ibridi somatici
tra le cultivars desiderate e le piante fissatrici, introducendo i geni della
fissazione (nif)
nei microrganismi simbionti o liberi;
-
Trasferimento della capacità di fissare l'azoto nei vegetali, utilizzando,
come vettori dei geni nif,
dei virus o dei plasmidi autotrasmissibili,
In
conclusione:
Le
ricerche di base destinate ad ottenere il trasferimento e l'espressione dei
geni della fissazione dell'azoto nelle cellule di vegetali superiori
porteranno molto verosimilmente a delle scoperte interessanti. In questo caso,
saranno indispensabili altre ricerche e verifiche prima di prendere in
considerazione la loro applicazione in campo agricolo. Hardy (1976) aveva
stimato che era necessario un tempo minimo di dieci anni per poter applicare,
in campo agronomico, una scoperta teorica come, per esempio, l'estensione
della simbiosi azotofissatrice ai cereali. Se
un cereale azotofissatore si potesse ottenere in laboratorio, sarebbero
necessarie molte prove e verifiche prima di coltivarlo normalmente e di
propagarlo, cioè da dieci a venti anni. Comunque sia, viene
attribuita a queste ricerche una importanza sempre più grande. Lo U.S.
Departement of Agriculture, per esempio, accorda la priorità alle ricerche
sulla fissazione biologica dell'azoto atmosferico che possono portare ad un
aumento della produttività vegetale: nel 1980, i contratti di ricerca
finanziati in questo campo rappresentavano il 25% dell'insieme dei
finanziamenti destinati alla ricerca in biologia vegetale.
creazione e propagazione di nuove varietà coltivate di piante
