Le conoscenze essenziali per lo sviluppo dell'ingegneria genetica sono schematizzate nella Figura sotto
l. Chimica del DNA: sviluppo di procedure per l'isolamento, il sequenziamento e la sintesi del DNA.
2. Enzimologia del DNA: isolamento di endonucleasi di restrizione, DNA ligasi e DNA polimerasi.
3. Replicazione del DNA: comprensione del meccanismo di replicazione del DNA e dell'importanza dei vettori in grado di replicarsi autonomamente.
4. Plasmidi: isolamento di plasmidi e determinazione del loro meccanismo di replicazione.
5. Batteriofagi temperati: comprensione del meccanismo di controllo della replicazione e/o integrazione da parte del DNA di batteriofagi temperati.
6. Trasformazione: individuazione di metodi per l'introduzione di DNA libero nelle cellule.
7. Chimica ed enzimologia dell'RNA: identificazione delle metodologie per l'estrazione e lo studio dell'mRNA, comprensione del meccanismo di formazione dell'RNA e dell'importanza del suo processamento nella formazione di un mRNA maturo eucariotico. Sviluppo di metodi per la sintesi di RNA.
8. Retrotrascrizione: identificazione dell'enzima virale trascrittasi inversa e suo sviluppo come mezzo per retrotrascrivere l'informazione genetica da mRNA al DNA.
9. Regolazione: comprensione dei fattori coinvolti nella regolazione della trascrizione, inclusa l'identificazione dei promotori e del controllo degli operoni.
10. Traduzione: comprensione delle tappe coinvolte nella traduzione, dell'importanza del sito di legame al ribosoma sull'mRNA, del ruolo del codone di inizio e dell'importanza di una corretta fase di lettura.
11. Chimica delle proteine: sviluppo di metodi per l'isolamento, la purificazione, la valutazione e il sequenziamento delle proteine.
12. Secrezione e modificazione post‑traduzionale delle proteine: comprensione del meccanismo di sintesi delle proteine prodotte con sequenze segnale, rimosse durante o dopo la secrezione. Identificazione di altri tipi di modificazioni post‑traduzionali delle proteine, come la rimozione di peptidi localizzati all'estremità aminoterminale.
13. Codice genetico: Individuazione del codice genetico e determinazione della sua universalità in quasi tutti gli organismi. Comprensione dell'importanza di una corretta fase di lettura e della presenza di alcuni codoni usati meno frequentemente in alcuni organismi rispetto ad altri.
Lo
scopo del clonaggio è quello di isolare grandi quantità di geni specifici in
forma pura. La strategia alla base consiste nel trasferimento del gene
desiderato da un genoma grande e complesso ad uno piccolo e semplice.
Fortunatamente, le nostre conoscenze di chimica e di enzimologia degli acidi
nucleici ci permettono di tagliare e riunire molecole di DNA in vitro.
Questo processo è noto come ricombinazione
in vitro.
Il clonaggio genico può essere suddiviso in 5 passaggi:
1. Isolamento e frammentazione del DNA.
2. Ligazione del frammento di DNA con un vettore di clonaggio mediante la DNA ligasi.
I
vettori di clonaggio sono generalmente costruiti per permettere l'introduzione
di DNA esogeno a livello di un sito di restrizione che taglia il vettore in modo
tale che non sia compromessa la sua replicazione. Se il vettore e il DNA che
deve essere inserito sono tagliati con lo stesso enzima di restrizione, la
successiva unione di queste due molecole può essere favorita dall'appaiamento
di regioni a singolo filamento denominate "estremità coesive". E`
possibile unire estremità piatte generate da enzimi di restrizione diversi;
inoltre estremità coesive diverse o estremità piatte possono essere congiunte
mediante l'uso di adattatori e di "linkers"
(giunzioni) costituiti da DNA sintetico.
3. Introduzione nell'ospite con la trasformazione o mediante l’infezione con particelle fagiche costruite mediante impacchettamento in vitro. L`incorporazione del DNA nell'ospite generalmente genera una miscela di cloni (genoteca).
4.
Isolamento e purificazione del clone desiderato.
5. Produzione di un elevato numero di cellule o batteriofagi contenenti il clone desiderato per l'isolamento e lo studio del DNA clonato.
Plasmidi come vettori di clonaggio
Essi hanno proprietà molto utili per il clonaggio. Queste proprietà includono:
(1) dimensioni ridotte che facilitano l'isolamento e la manipolazione del DNA;
(2) forma circolare che rende il DNA più stabile durante l'isolamento;
(3) origine di replicazione indipendente, in modo tale che la replicazione del plasmide nella cellula proceda indipendentemente dal controllo diretto del cromosoma;
(4) elevato numero di copie nella cellula che rende possibile l'amplificazione del DNA;
(5) presenza di marcatori selezionabili, quali la resistenza ad antibiotici, che semplificano l'identificazione e l'isolamento dei cloni contenenti plasmidi.
Sebbene in condizioni naturali i plasmidi coniugativi siano generalmente trasferiti attraverso il contatto tra le cellule, i vettori di clonaggio vengono spesso modificati, per ragioni di sicurezza, per prevenire il loro trasferimento mediante coniugazione. Infatti, in laboratorio, l'introduzione di un vettore in un ospite può essere effettuato mediante trasformazione. A seconda del sistema ospite‑plasmide, la replicazione del plasmide può avvenire sotto stretto controllo cellulare, nel qual caso le copie prodotte sono poche, oppure con un controllo cellulare più blando e la produzione di un numero elevato di copie. Spesso in un clonaggio genico è importante avere un alto numero di copie; attraverso un`appropriata scelta del sistema ospite-plasmide e l'alterazione della sintesi delle macromolecole cellulari è possibile ottenere diverse migliaia di plasmidi per cellula.
Il plasmide pBR322
è un esempio di un vettore di clonaggio molto usato, in grado di replicarsi In Escherichia
coli. Il plasmide pBR322 ha diverse caratteristiche che lo rendono utile come
vettore di clonaggio:
I. E` relativamente piccolo, solo 4361 paia di basi.
2. Si mantiene stabilmente nel suo ospite (Escherichia coli) ad un numero relativamente alto di copie per cellula (20-30).
3. Può essere amplificato fino ad un numero elevato (1000‑3000 copie per cellula, circa il 40% del genoma!) mediante l'aggiunta di cloramfenicolo, che inibisce la sintesi proteica.
4. E` facile da isolare in forma superavvolta mediante diverse tecniche semplici .
5. E` possibile l'inserimento di una discreta quantità di DNA, nonostante che inserti superiori alle 10 chilobasi portino alla instabilità plasmidica.
6. Essendo nota l'intera sequenza delle basi di questo plasmide, è possibile localizzare i siti riconosciuti da enzimi di restrizione.
7. Sono presenti siti unici per diversi enzimi di restrizione come PstI, SalI, EcoRI, HindIII, BamHI e molti altri. Il sito EcoRI è localizzato tra i geni che codificano per la resistenza agli antibiotici presenti sul plasmide. È importante la presenza di un sito unico per almeno un enzima di restrizione, in modo tale che il trattamento con quell'enzima linearizzi il plasmide, senza frammentarlo.
8. Sono presenti due marcatori di resistenza agli antibiotici, ampicillina e tetraciclina che permettono una facile selezione delle cellule ospiti contenenti il plasmide.
9. Può essere facilmente introdotto nelle cellule mediante la trasformazione. Come abbiamo visto, il sito BamHI è all'interno del gene per la resistenza alla tetraciclina e il sito PstI in quello per la resistenza all'ampicillina. Se un frammento di DNA esogeno viene inserito in uno di questi siti, la resistenza all'antibiotico conferita dal gene localizzato in quel punto viene persa con un fenomeno detto inattivazione inserzionale. Questa inattivazione è utilizzata per identificare la presenza di DNA esogeno nel plasmide. Quindi, se pBR322 viene digerito con BamHI, legato al DNA da inserire e successivamente vengono isolati i cloni batterici trasformati, i cloni selezionati che risultano resistenti sia all'ampicillina che alla tetraciclina sono quelli che non hanno inserito il DNA esogeno (il plasmide incorporato nella cellula è il vettore che si è richiuso senza introduzione di DNA esogeno). Al contrario, quelle cellule che sono ancora resistenti all'ampicillina, ma sensibili alla tetraciclina, contengono il plasmide nel quale si è inserito DNA esogeno. Poiché la resistenza a questi due antibiotici può essere valutata su piastre di terreno agarizzato, è possibile individuare facilmente i batteri contenenti il clone desiderato ed eliminare le cellule che non contengono il plasmide.
I primi vettori di clonaggio utilizzati sono stati i plasmidi presenti in natura. Il plasmide pBR322 rappresenta una generazione più recente di vettori di clonaggio, costruiti in vitro. Il gene per la resistenza alla tetraciclina in pBR322 deriva da un plasmide, l'origine di replicazione da un altro e il gene per la resistenza all'ampicillina dal trasposone Tn3. Sono ora disponibili nuove generazioni di vettori plasmidici costruiti con caratteristiche utili e di facile impiego. Queste nuove caratteristiche includono quasi sempre un "polylinker" (o sito di clonaggio multiplo), un breve segmento di DNA con molti siti di restrizione unici. Questo "polylinker" è generalmente contenuto nella regione codificante di un gene la cui inattivazione inserzionale può essere facilmente identificata. Queste caratteristiche si ritrovano anche nei vettori fagici.
Il clonaggio in un plasmide come pBR322 è una procedura versatile e abbastanza generale, di uso diffuso in ingegneria genetica, in particolare quando il frammento che deve essere clonato è abbastanza piccolo. I plasmidi sono i vettori migliori quando si desidera l'espressione del gene che si è clonato.
Batteriofagi come vettori di clonaggio
Abbiamo discusso il batteriofago lambda e il fatto che possa essere utilizzato come fago trasducente specializzato. Durante la trasduzione specializzata, lambda si comporta come un vettore, anche se la ricombinazione non avviene in provetta ma nella cellula. Lambda può anche essere utilizzato come vettore di clonaggio per la ricombinazione in vitro. E` un vettore particolarmente utile poiché è ben conosciuto da un punto di vista molecolare, può contenere quantità di DNA più elevate della maggior parte dei plasmidi e il DNA può essere efficientemente impacchettato nelle particelle fagiche in vitro. Inoltre, può essere utilizzato per infettare opportune cellule ospiti (trasfezione), processo molto più efficiente della trasformazione. Il fago lambda ha una mappa genetica complessa ed un elevato numero di geni. Tuttavia, la regione centrale del genoma di lambda, compresa tra i geni J ed N, non è essenziale e può essere sostituita con DNA esogeno.
Vettori
derivati dal fago lambda
Il fago lambda "wild-type" non è un vettore di clonaggio adeguato poiché possiede molti siti per enzimi di restrizione. Per superare questo inconveniente sono stati costruiti fagi lambda modificati utilizzabili per il clonaggio. In un gruppo di fagi lambda modificati, chiamati fagi "Charon' (Caronte), i siti di restrizione indesiderati sono stati rimossi attraverso mutazioni puntiformi, delezioni o sostituzioni. In questi derivati in cui è presente un solo sito di restrizione, il pezzo di DNA esogeno viene inserito, mentre nei derivati con due siti il DNA esogeno può sostituire parte del DNA del fago. Questo secondo tipo di vettore, denominato vettore di sostituzione, è particolarmente utile quando deve essere clonato un frammento di DNA di grosse dimensioni. Entrambi i vettori presentano mutazioni per sostituzione. Uno dei geni inseriti per sostituzione è quello della b-galattosidasi. Quando il vettore si replica in un ceppo di Escherichia coli incapace di utilizzare il lattosio (Lac-), la b-galattosidasi viene sintetizzata dal gene portato dal fago e la presenza di placche Lac+ (lattosio positive) può essere evidenziata in piastra mediante l'impiego di un indicatore che cambia colore in funzione dell'espressione o meno della b-galattosidasi. Se un gene esogeno viene inserito nel gene per la b-galattosidasi, il carattere Lac+ viene perso[B.P.2]. In queste condizioni le placche Lac- possono essere facilmente identificate come placche bianche in mezzo ad una miriade di placche colorate.
Clonaggio
con lambda
Il clonaggio con i vettori derivati da lambda prevede i seguenti passaggi:
1. Isolamento del vettore da particelle fagiche e sua digestione con l`enzima di restrizione appropriato.
2. Unione dei due frammenti di lambda con il frammento di DNA esogeno mediante DNA ligasi. Le condizioni scelte permettono la formazione di molecole di DNA di lunghezza tale da poter essere inserito nella particella fagica mediante impacchettamento.
3. Impacchettamento del DNA mediante aggiunta di estratti cellulari contenenti le proteine della testa e della coda che permettono la formazione di particelle fagiche vitali.
4. Infezione di E. coli e isolamento dei cloni fagici mediante replica delle placche in un ceppo ospite.
5. Controllo della presenza del frammento di DNA desiderato nei fagi ricombinanti, mediante tecniche di ibridazione o osservazione delle caratteristiche genetiche.
La selezione dei ricombinanti è più semplice con i vettori derivati da lambda (es. "Charon" 4A) rispetto ai plasmidi, poiché (1) l'efficienza di trasferimento nella cellula del DNA ricombinante mediata da lambda è molto alta, (2) I frammenti di lambda che non hanno ricevuto DNA esogeno sono troppo piccoli per essere incorporati nelle particelle fagiche. Sebbene lambda sia un utile vettore di clonaggio ci sono dei limiti nella quantità di DNA che può essere inserita. La vitalità delle particelle fagiche è bassa se il DNA è più lungo del 105 percento del genoma normale di lambda ed inoltre alcuni geni non possono essere eliminati senza che il vettore perda la sua capacità di replicarsi. Quindi frammenti di DNA di grosse dimensioni (più di 20 chilobasi) non possono essere efficientemente clonati.
Cosmidi
Un cosmide è un vettore che utilizza specifici geni di lambda. I cosmidi sono vettori plasmidici in cui sono stati inseriti i siti cos (estremità coesive) del genoma di lambda. Questi siti sono richiesti per impacchettare il DNA nel virione di lambda. I plasmidi modificati possono essere impacchettati in vitro nel virione lambda, come descritto sopra, e le particelle fagiche utilizzate per trasdurre Escherichia coli. Quindi, utilizzando i cosmidi, non è richiesta la trasformazione di E. coli, processo poco efficiente.
Uno dei maggiori vantaggi forniti dai cosmidi è dato dalla possibilità di clonare grossi frammenti di DNA.
In queste condizioni sono
sufficienti pochi cloni perché l'intero elemento genetico possa essere
rappresentato. Questo è utile soprattutto per il clonaggio di geni
cromosomali di eucarioti dove sono presenti grandi quantità di DNA. Un altro
vantaggio dei cosmidi è dato dal fatto che il DNA può essere immagazzinato in
una particella fagica invece che in un plasmide. Le particelle fagiche sono
molto più stabili di un plasmide e il DNA ricombinante può essere mantenuto
per lunghi periodi di tempo (genoteca).
Sono stati sviluppati diversi vettori utilizzabili per scopi differenti nella tecnologia del DNA ricombinante. In questo paragrafo discuteremo altri tipi di vettori e alcune loro modificazioni utili.
Cromosomi artificiali di lievito o YAC (yeast artificial chromosomes) e progetto genoma umano
Come abbiamo già ricordato, i
vettori plasmidici generalmente possono contenere una quantità di DNA inferiore
ai vettori lambda che a loro volta ne contengono meno rispetto ai cosmidi.
Quando si deve costruire una genoteca di batteri o eucarioti semplici è
possibile usare vettori lambda o cosmidi; in questi casi l'intera genoteca
conterrà al massimo poche migliaia di cloni diversi. Le dimensioni di una
genoteca (cioè il numero di cloni) richieste perché possa essere contenuto il
genoma completo di un organismo dipendono sia dalle dimensioni del genoma, sia
dalla lunghezza dei frammenti inseriti nel vettore. Se la dimensione media
dell'inserto è 20 chilobasi, saranno necessari molti più cloni per costruire
una genoteca di un genoma di mammifero (3 x 109 paia di basi)
rispetto a quelli richiesti per un genoma batterico (4 x 106 paia di
basi). Attualmente gli
sforzi della comunità scientifica Internazionale sono rivolti alla mappatura,
clonaggio e sequenziamento dell'intero genoma umano aploide (Progetto genoma
umano). Si tratta chiaramente di un`impresa molto più impegnativa del
sequenziamento del cromosoma di Escherichia
coli. Per
un progetto del genere è necessario disporre di un vettore di clonaggio che
possa contenere grossi segmenti di DNA per limitare le dimensioni della genoteca.
Sono stati costruiti vettori di questo genere denominati cromosomi
artificiali di lievito o YAC (yeast artificial chromosomes).
I vettori YAC sono in grado di replicarsi in lievito come normali cromosomi, ma contengono siti dove può essere inserito DNA. Per poter funzionare come normali cromosomi eucariotici, i vettori YAC devono avere:
1. un origine di replicazione,
2. telomeri all'estremità del cromosoma
3. un centromero (la porzione del cromosoma richiesta per la segregazione durante la mitosi).
4. Inoltre devono contenere un sito di clonaggio e un gene che possa essere utilizzato per la selezione dell'ospite dopo trasformazione.
Le dimensioni
di un vettore YAC sono solo circa 10 chilobasi, ma possono contenere da 200
a 800 chilobasi di DNA clonato. Dopo l'identificazione di un gene
particolare o di una regione del DNA clonato nel vettore YAC, è possibile
subclonarlo in un plasmide o in un batteriofago per un'analisi genetica più
dettagliata.
Vettori per il sequenziamento del DNA: il batteriofago M13
Questo fago filamentoso contiene DNA a singolo filamento e si replica senza uccidere il suo ospite. Le particelle mature di M13 vengono rilasciate dalla cellula ospite attraverso un processo di gemmazione, ed è possibile ottenere colture cronicamente infettate che possono fornire DNA fagico. Un`importante caratteristica del fago M13 è quella di contenere DNA a singolo filamento. Per sequenziare il DNA utilizzando la metodica di Sanger, è necessario disporre di DNA a singolo filamento e il DNA clonato nel fago M13 fornisce una fonte di DNA di questo tipo. Inoltre, il DNA a singolo filamento è molto utile come sonda per individuare altre sequenze di DNA, come in esperimenti di ibridazione dopo trasferimento tipo Southern, e M13 permette di produrre facilmente sonde a singolo filamento.
Per poter essere utilizzato per il clonaggio, il fago M13 deve
essere disponibile anche in forma a doppia elica, poiché gli enzimi di
restrizione tagliano solo il DNA a doppio filamento. È possibile ottenere DNA
di M13 a doppia elica dalle cellule infettate, in quanto M13 si replica
nell'ospite attraverso una forma replicativa a doppia elica.
La maggior parte del genoma del fago M13 "wíldtype" contiene l'informazione genetica essenziale per la replicazione virale. Esiste tuttavia una piccola regione, denominata sequenza intergenica, che può essere utilizzata come sito di clonaggio. Senza compromettere la vitalità del fago è possibile clonare molecole di DNA di lunghezza variabile, fino a 5 kb, in quanto le dimensione del virione si adattano a quelle del suo genoma. Il fago M13mp18 è un derivato di M13 nel quale la regione intergenica è stata modificata per facilitare il clonaggio.
Una modificazione consiste nell'introduzione del gene lacZ, che in E. coli codifica l'enzima b‑galattosidasi. Quindi, le cellule infettate con M 13mp18 possono essere facilmente identificate grazie al colore che assumono in piastre con un indicatore. Nel gene lacZ è stato inserito un polylinker di 54 paia di basi. Questo frammento contiene diversi siti di restrizione unici nel fago M13 e può quindi essere utilizzato per il clonaggio. Il polylinker è inserito all'inizio della regione codificante il gene lacZ. Questa piccola regione è in fase e i 18 aminoacidi aggiunti non alterano l'attività dell'enzima codificato dal gene. Tuttavia, l'inserimento di DNA nel polylinker durante il clonaggio inattiva il gene. I fagi che contengono DNA esogeno formano placche non colorate e quindi risulta molto semplice identificare i cloni. Viene utilizzata una strategia simile anche nei vettori di clonaggio di lambda per permettere l'identificazione di cellule contenenti il DNA clonato.
Come sono utilizzati i vettori M13 per il clonaggio? La forma replicativa a doppia elica di DNA viene isolata dalla cellula infettata e trattata con un enzima di restrizione. Il DNA da clonare, a doppia elica, viene trattato con lo stesso enzima di restrizione. Dopo la ligazione si ottengono molecole di M13 a doppia elica contenenti il DNA esogeno. Quando, mediante trasformazione, queste molecole vengono introdotte nella cellula, si replicano e danno origine a particelle fagiche mature contenenti molecole di DNA a singolo filamento. Solo un filamento di DNA viene impacchettato nel fago maturo. Quale delle due eliche di DNA esogeno è contenuta nel fago maturo, dipende dall'orientamento con il quale è avvenuto l'inserimento del filamento. E possibile il clonaggio di entrambi i filamenti di DNA poiché le molecole di DNA esogeno possono inserirsi (in fagi diversi) in entrambi gli orientamenti. Il DNA di M13 a singolo filamento contenente il DNA clonato può essere utilizzato per il sequenziamento. Poiché è nota la sequenza delle basi in cui si è inserito il DNA esogeno (essendo nota la specificità dell'enzima di restrizione usato), è possibile sfruttare come innesco un olìgonucleotide sintetico complementare a questa regione e determinare la sequenza dell`intero frammento di DNA a partire da questo punto. Quindi, i fagi derivati da M13 si rivelano estremamente utili per il sequenziamento di molecole, anche piuttosto lunghe, di DNA esogeno. (In questo modo è stata determinata la sequenza del DNA del batteriofago lambda di 48.514 basi).
NOTA:.E` stato costruito un sistema modificato per la produzione di molecole di DNA a singolo filamento inserendo l'origine di replicazione del fago M13 in un vettore plasmidico. Questi plasmidi possono essere usati sia per la manipolazione genetica convenzionale sia per produrre molecole di DNA a singolo filamento infettando cellule contenenti questo plasmide, in presenza di un fago M 13 "helper".
Sono stati costruiti anche vettori ibridi, denominati fasmidi, derivati da un fago filamentoso come M13 e un plasmide. Questi vettori contengono sia l'origine di replicazione del fago sia quella del plasmide. Normalmente la replicazione inizia dal sito di origine del plasmide ma, quando una cellula contenente un fasmide è infettata con un fago "wild-type", l'origine del fago nel vettore viene utilizzata per sintetizzare DNA a singolo filamento (e qualunque gene clonato). Questo DNA a singolo filamento è impacchettato nel virione e, può essere facilmente isolato ed utilizzato per il sequenziamento. Generalmente, i fasmidi possono portare stabilmente frammenti di DNA clonato più grandi di quelli normalmente contenuti in un vettore derivato dal fago M13.
Altri
vettori specializzati
Un'importante classe di vettori, denominati vettori di espressione, vengono utilizzati quando si desidera ottenere la sintesi della proteina codificata dal gene esogeno clonato nel vettore. I vettori di secrezione sono particolari vettori di espressione in cui la proteina non solo è espressa, ma anche secreta (escreta) dalla cellula.
Per diverse ragioni può essere utile trasferire
frammenti di DNA tra organismi anche non correlati, ad esempio quando un
gene di interesse non è presente in un ceppo "wild-type"
di E. coli, ma in un`aItra specie
batterica. In questi casi, per trasferire il frammento di DNA, si utilizza un vettore
navetta (shuttle), un
vettore in grado di replicarsi in due organismi diversi. Come molti altri
vettori specializzati, anche i vettori navetta possono essere costruiti mediante
le tecniche del DNA ricombinante. Sono noti vettori navetta in grado di
replicarsi in E. coli e in Bacillus
subtilis, in E. coli e in
lievito, In E. coli e in cellule di
mammifero e in molte altre coppie di organismi.
ospiti
per i vettori di clonaggio
Le caratteristiche ideali di un ospite per il clonaggio dei geni sono:
Gli ospiti più utili per il clonaggio sono microrganismi, come E. coli. Bacillus subtilis e Saccaromyces cerevisiae, che crescono facilmente e sono noti da un punto di vista genetico.
Ospiti
procarioti
Sebbene E. coli sia stato molto sfruttato per il clonaggio non sempre il suo utilizzo è vantaggioso. E. coli è un batterio che vive nell'intestino ed essendo potenzialmente patogeno, risulta poco adatto per la produzione su larga scala di composti derivati da DNA clonato. Inoltre, persino ceppi non patogeni possono produrre endotossine che potrebbero contaminare il prodotto, situazione particolarmente pericolosa per i prodotti farmaceutici iniettabili. Infine, E. coli trattiene le proteine prodotte nello spazio periplasmico rendendo difficile la loro estrazione e purificazione. Tuttavia sono stati selezionati ceppi di E. coli modificati che hanno permesso di superare molti di questi problemi. Grazie infatti alla disponibilità di molte informazioni, sia genetiche sia biochimiche, E. coli rimane l'ospite più adatto per il clonaggio nella ricerca di base.
Anche il batterio Gram-positivo Bacillus subtilis può essere sfruttato come ospite per il clonaggio. B. subtilis non è potenzialmente patogeno, non produce endotossine e secerne le proteine prodotte nel terreno di coltura. Sebbene le tecnologie per il clonaggio in Bacillus subtilis non siano così sviluppate come quelle in E. coli, sono comunque disponibili plasmidi e fagi adatti e sono state messe a punto procedure di trasformazione adeguate. Esistono comunque alcuni svantaggi nell'utilizzazione di B. subtilis come ospite per il clonaggio. Uno dei problemi è legato all'instabilità plasmidica; è difficile mantenere la replicazione del plasmide dopo molti passaggi in coltura. Inoltre, il DNA esogeno non si mantiene facilmente in B. subtilis e viene spesso perso improvvisamente.
L`adattamento di un batterio da utilizzare come ospite di clonaggio non è sempre semplice.
Ospiti
eucarioti
Il clonaggio nei microrganismi eucariotici ha alcuni vantaggi importanti legati soprattutto alla comprensione della regolazione genica in sistemi eucariotici. Il lievito Saccaromyces cerevisiae è il microrganismo eucariotico più conosciuto dal punto di vista genetico e più studiato come ospite per il clonaggio. Per il clonaggio in lievito, sono stati sviluppati vettori come i plasmidi YAC che permettono la trasformazione con DNA geneticamente manipolato. La capacità di clonare in lievito materiale genetico opportuno permetterà di approfondire le nostre conoscenze sui complessi sistemi di trascrizione e traduzione degli eucarioti e fornirà ulteriori informazioni per la ricerca di base.
Spesso, per diverse ragioni è preferibile procedere al clonaggio in cellule di mammifero. Le colture di cellule di mammifero, come quelle batteriche, possono essere manipolate in diversi modi e trovano largo impiego nelle ricerche di genetica umana, biologia dei tumori, malattie infettive e fisiologia. Il DNA può essere introdotto nelle cellule dì mammifero attraverso la trasfezione o l'elettroporazione. Il virus a DNA SV40, un virus che causa tumori nei primati, viene utilizzato come vettore per il clonaggio in colture di linee cellulari di tessuti umani. SV40 è un virus il cui genoma, costituito da una molecola di DNA circolare a doppia elica, è stato interamente sequenziato. Per il clonaggio e l'espressione di geni di mammifero sono stati costruiti derivati del fago SV40 incapaci di indurre il cancro. SV40 e vettori di clonaggio simili dovrebbero rivelarsi estremamente utili per comprendere i meccanismi coinvolti nell'espressione genica degli organismi più complessi.
Anche i retrovirus possono essere utilizzati per introdurre geni in cellule di mammifero, in quanto si replicano attraverso un intermedio a DNA che si integra nel genoma dell'ospite. Anche il virus del vaiolo bovino, un grosso virus il cui genoma è costituito da una molecola di DNA a doppia elica, è stato utilizzato per clonare diversi geni virali, utilizzabili per la preparazione di vaccini.
Un importante vantaggio nell'uso delle cellule eucariotiche come ospiti di vettori di clonaggio, è legato al fatto che esse posseggono già i complessi sistemi di modificazione dell`RNA e di processamento post‑traduzionale coinvolti, negli organismi superiori, nella sintesi di un prodotto genico. Questi sistemi non devono, quindi, essere introdotti nel vettore come avviene quando la produzione della molecola desiderata viene effettuata in un procariote (in particolare i processi post-traduzionali possono creare alcuni problemi nel clonaggio).
Uno svantaggio nell'utilizzazione di cellule di mammifero come ospiti per il clonaggio è dato dal fatto che, oltre ad essere costose e difficili da produrre su larga scala, presentano spesso livelli di espressione dei geni clonati piuttosto bassi. Poiché linee cellulari di insetto sono più semplici da crescere, sono stati sviluppati vettori di clonaggio basati su un virus a DNA, il baculovirus, in grado di infettare gli insetti. Usando il baculovirus come vettore, si possono ottenere livelli di espressione molto alti.
identificazione del clone corretto
Un punto cruciale nella tecnologia del DNA ricombinante, è l'identificazione del clone corretto nella miscela di cloni che si è formata. Il DNA utilizzato per il clonaggio contiene in genere molti geni, dei quali solo uno o pochi possono essere i geni di interesse. Abbiamo visto come sia possibile selezionare l'ospite contenente il vettore basandoci sulla presenza di un marcatore, come la resistenza ad un antibiotico, portato dal plasmide, in modo che solo queste cellule formeranno colonie. Nel caso di cellule contenenti un vettore virale è possibile osservare semplicemente la formazione di placche. Abbiamo anche visto come le colonie o le placche possano essere analizzate per isolare quelle che presentano all'interno del plasmide un inserto di DNA esogeno, osservando l'inattivazione di un gene del vettore, quale la resistenza ad un antibiotico, nel caso di un plasmide o della b-galattosidasi, nel caso di un virus. Tuttavia, diventa poi necessario selezionare il clone che contiene il gene di interesse. Sono disponibili diverse procedure per esaminare colonie batteriche o placche di cellule infettate in grado di crescere su una piastra di terreno agarizzato e isolare quelle poche che contengono piccole quantità della proteina o del gene che interessa. Lo scopo di questo paragrafo è quello di discutere i possibili approcci per l'isolamento del clone corretto. Considereremo prima il caso in cui il gene viene espresso (cioè la proteina è sintetizzata) nell'ospite e, quindi, il caso piuttosto comune, in cui il gene non è espresso e si dovrà ricercare il DNA stesso.
Il gene esogeno è
espresso nell'ospite
Se il gene esogeno viene espresso (cioè la proteina viene sintetizzata) nell'ospite, si possono sfruttare diversi approcci che evidenziano la presenza della proteina nei cloni ricombinanti. In questo caso l'ospite utilizzato non deve essere in grado di produrre la proteina in esame. Individuare i cloni che esprimono il gene significa cercare quelle poche colonie in cui la proteina è presente. Se l'ospite produce normalmente quella proteina, allora è necessario che sia difettivo, cioè presenti una mutazione in quel gene. In questo caso, quando avviene l'introduzione del gene esogeno, la sua espressione sarà evidenziata dalla complementazione. Ovviamente, se l'ospite esprime già una proteina con la medesima attività, risulta difficile evidenziare la proteina codificata dal gene esogeno. Se il prodotto del gene che si è clonato è una proteina eucariotica che l'ospite batterico normalmente non produce, allora quest'ultimo è naturalmente difettivo per quel gene. Un esempio singolare è il clonaggio in Escherichia coli del gene della luciferasi di coleotteri luminescenti; al buio i cloni appaiono di colori diversi a seconda del tipo di luciferasi presente.
Gli
anticorpi come mezzo per l'identificazione di proteine
Quando le proteine non hanno una funzione facilmente identificabile, è necessario un approccio di tipo diverso. E` possibile utilizzare un anticorpo come reagente specifico nei confronti della proteina di interesse. La proteina di interesse è l'antigene e viene utilizzata per produrre un anticorpo in un animale da laboratorio. Poiché l'anticorpo si combina specificamente con l'antigene, se l'antigene è presente in una o più colonie della piastra può essere localizzato osservando il legame all'anticorpo. Poiché nelle colonie è presente solo una piccola quantità di proteina (antigene) che lega solo una piccola quantità di anticorpo, è necessario disporre di un metodo di identificazione dell'anticorpo legato estremamente sensibile. In pratica viene utilizzato un sistema radioattivo che permette di evidenziare l'anticorpo legato tramite autoradiografia, usando lastre per raggi X.
·La procedura di "replica plating" viene utilizzata per riprodurre su un filtro, sul quale verranno effettuate poi tutte le manipolazioni, una copia della piastra madre.
·Le colonie duplicate vengono parzialmente lisate per permettere il rilascio della proteina (antigene) di interesse.
·Si procede poi all'aggiunta dell'anticorpo e si lascia avvenire la reazione antigene‑anticorpo.
·Dopo il lavaggio dell'anticorpo non legato, si procede all'aggiunta dell'agente radioattivo che è specifico per l'anticorpo. Infine si pone sopra il filtro una lastra autoradiografica e si espone.
Se
è presente una colonia radioattiva si osserverà sulla lastra, dopo il suo
sviluppo, una piccola macchia. La localizzazione sulla lastra di questo segnale
corrisponde sulla piastra madre alla colonia che produce la proteina. Questa
colonia può quindi essere prelevata dalla piastra madre e messa in coltura.
Le
sonde ad acidi nucleici: ricerca del gene
Supponiamo che nell'ospite in cui
è avvenuto il clonaggio non ci sia espressione del gene o che non siano
disponibili test o anticorpi per l'identificazione del prodotto genico. Come è
possibile identificare la presenza del gene nelle colonie? L`approccio più
adatto è quello di utilizzare una
sonda ad acidi nucleici che contenga
una porzione chiave della sequenza di basi del gene che interessa.
L'ibridazione di un acido nucleico può essere sfruttata come strumento per
individuare polinucleotidi con sequenze specifiche. Sia
il DNA che l'RNA possono essere sfruttati come sonde. La
procedura generale prevede l'ibridazione tra la sonda a singolo filamento, dopo
che è stata marcata con fosforo radioattivo, e la singola elica derivata dal
DNA clonato. A causa dell'estrema specificità di appaiamento delle basi,
due sequenze nucleotidiche a singolo filamento ibridano solo se quasi
completamente complementari . Usando opportune condizioni di ibridazione è
possibile ottenere il legame della sonda radioattiva solo all'acido nucleico di
interesse.
Per le applicazioni pratiche è essenziale disporre di un sistema in cui il gene clonato possa essere espresso. Gli organismi viventi posseggono complessi sistemi di regolazione e molti geni non sono sempre espressi. Uno degli obiettivi più importanti dell'ingegneria genetica è lo sviluppo di vettori in cui possa esserci un alto livello di espressione del gene.
Un vettore di espressione è il gene desiderato, ma che contiene anche le sequenze di regolazione necessarie perché l'espressione del gene sia mantenuta sotto il controllo del ricercatore.
Caratteristiche di un sistema di espressione efficiente Un vettore deve essere costruito in modo tale che siano mantenuti sotto controllo i fattori che influenzano il livello di espressione di un gene. Inoltre, si deve utilizzare un ospite nel quale quel vettore di espressione sia molto efficiente. Riassumiamo ora le caratteristiche essenziali di un sistema di espressione efficiente.
1. Numero di copie del gene per cellula. In generale, la quantità di proteina prodotta è maggiore quando nella cellula è presente un numero elevato di copie del gene. I vettori, come i plasmidi di piccole dimensioni (per esempio pBR322), sono molto utili perché possono replicarsi ad alto numero di copie. Talvolta, spesso a scopo di ricerca, è desiderabile avere una sola copia del gene clonato all'interno della cellula. Per questo motivo sono stati sviluppati vettori di integrazione per cui il gene può ricombinare all'interno del cromosoma dell'ospite.
2. Forza del promotore. La regione del promotore è il sito a cui si lega la RNA polimerasi. Promotori di geni diversi variano considerevolmente nella forza di legame alla RNA polimerasi. Per costruire un sistema che possa essere utile per le diverse applicazioni è necessario includere nel vettore di espressione un promotore forte. Nei batteri la regione di DNA localizzata a 10 e 35 nucleotidi prima del sito di inizio della trascrizione (chiamate regioni -10 e -35) sono estremamente importanti nel promotore. Molti geni di Escherichia coli sono controllati da un promotore relativamente debole e promotori provenienti da eucarioti o altri procarioti funzionano poco o nulla in questo microrganismo.
Un nuovo sistema di regolazione è stato costruito utilizzando il promotore e la RNA polimerasi del batteriofago T7. Quando T7 infetta E. coli, il fago codifica una RNA polimerasi in grado di riconoscere esclusivamente i promotori di T7, sospendendo l'attività di trascrizione dell'ospite. Nei vettori di espressione è possibile porre il frammento di DNA che si intende clonare sotto il controllo di un promotore di T7; se questo viene fatto, è necessario introdurre nel plasmide il gene per la RNA polimerasi di T7. Quest'ultimo viene posto sotto il controllo di un promotore facilmente regolabile come quello di lambda o di lac. Poco tempo dopo la trascrizione dell'RNA polimerasi di T7, si ha l'espressione dei geni clonati. Poiché questa RNA polimerasi riconosce solo i promotori di T7, trascrive solo i geni clonati, mentre tutti gli altri geni dell'ospite non vengono trascritti.
3. Presenza di un sito di legame al ribosoma batterico. L`mRNA trascritto deve legarsi fortemente al ribosoma perché possa avere inizio la traduzione e la parte iniziale del trascritto deve contenere la sequenza di legame al ribosoma (sequenza di Shine‑Dalgarno). Poiché i siti per il legame al ribosoma batterico non sono presenti nei geni eucariotici, è essenziale che questa regione sia introdotta nel frammento di DNA clonato se si desidera avere un alto livello di espressione del gene.
4. Una corretta fase di lettura. In alcuni casi il sito di legame al ribosoma e il codone di inizio del gene che deve essere clonato fanno parte del vettore di espressione. A seconda del meccanismo mediante il quale il DNA da clonare è fuso nel vettore si possono avere tre possibili fasi di lettura, una sola delle quali è appropriata. Se non si conosce la corretta fase di lettura, è possibile utilizzare tre diversi vettori ognuno con il sito di restrizione, in cui viene inserito il DNA da clonare, in posizione tale da generare differenti fasi di lettura. Il gene viene inserito nei tre vettori e viene selezionato quello che dà espressione appropriata.
5. Uso dei codoni. La maggior parte dei 20 aminoacidi è codificata da più di un codone e spesso alcuni sono usati più frequentemente di altri. La scelta dei codoni da utilizzare è in parte funzione della concentrazione del tRNA appropriato presente nella cellula. Un codone frequentemente usato in una cellula di mammifero può esserlo meno nell'organismo in cui il gene è stato clonato. L`inserimento del codone appropriato è difficile in quanto è un processo che andrebbe applicato a tutta la lunghezza del gene. Se necessario, questo può essere fatto utilizzando DNA sintetico o attraverso mutagenesi sito-diretta per creare un gene che meglio risponde ai tipi di codoni utilizzati dall'ospite.
6.
Destino della proteina dopo la sua produzione.
·Alcune proteine sono sensibili alla degradazione da parte di proteasi intracellulari e possono essere distrutte prima del loro isolamento.
·Le proteine di secrezione devono avere un`opportuna sequenza segnale per poter attraversare la membrana citoplasmatica.
· Alcune proteine eucariotiche sono tossiche per l'ospite procariotico che può essere ucciso prima che una sufficiente quantità di prodotto venga sintetizzata. Per eliminare questi problemi può essere necessaria un'ulteriore manipolazione sia dell'ospite che del vettore.
È quindi essenziale
costruire vettori appropriati che possano essere (1) efficientemente introdotti
in un ospite opportuno. (2) replicati ad alto numero di copie, (3)
efficientemente trascritti e, (4) efficientemente tradotti. Molte proteine di
mammifero non vengono espresse quando i loro geni sono clonati in E.
coli, ma l'espressione può talvolta essere raggiunta con un'opportuna
manipolazione del vettore. L`esempio migliore è dato dalla produzione su scala
industriale dell'insulina umana in E. coli.
Sono disponibili diverse tecniche per la sintesi di brevi segmenti di DNA con una specifica sequenza di basi. Il DNA sintetico è ampiamente utilizzato nella genetica molecolare, soprattutto nell'ingegneria genetica, ma anche nella ricerca di base. Le procedure per la sintesi del DNA possono essere completamente automatizzate in modo tale che un oligonucleotide di 30-35 basi può essere facilmente costruito in poche ore e, se necessario, possono essere prodotti oligonucleotidi di lunghezza superiore alle 100 basi. Per la sintesi di polinucleotidì più lunghi, i frammenti oligonucleotidici possono essere uniti enzimaticamente sfruttando la DNA ligasi.
USO: ·Le molecole di DNA sintetico sono largamente utilizzate come sonde in ingegneria genetica per identificare, attraverso ibridazione, specifiche sequenze di DNA.
· Infine, il DNA sintetico può essere ampiamente utilizzato nella costruzione di inneschi per la reazione a catena della polimerasi, detta PCR (vedi sotto).
Amplificazione del DNA: reazione a catena della polimerasi (PCR)
Per convenzione i sistemi di clonaggio genico vengono considerati mezzi di amplificazione del DNA in vivo. La tecnologia del DNA sintetico ha permesso lo sviluppo di un nuovo metodo, denominato reazione a catena della polimerasi (PCR, polymerase chain reaction), che permette una rapida amplificazione in vitro del DNA. Con la reazione a catena della polimerasi, è possibile amplificare in provetta molecole di DNA fino a un miliardo di volte, fornendo una grande quantità di specifici geni utilizzabili per il clonaggio, il sequenziamento o la mutagenesi.
La PCR impiega l'enzima DNA polímerasi per copiare le molecole di DNA.
La PCR richiede che sia nota la sequenza nucleotidica di una porzione del gene desiderato. Sono infatti necessarie, perché la PCR possa funzionare, brevi sequenze oligonucleotidiche, denominate inneschi, complementari a sequenze del gene o dei geni che devono essere amplificati.
I passaggi per l'amplificazione del DNA sono i seguenti:
(1) due inneschi fiancheggianti il DNA bersaglio (Figura b) vengono prodotti mediante un sintetizzatore di oligonucleotidi e aggiunti in grande eccesso al DNA bersaglio, denaturato mediante calore (Figura a).
(2) Quando la miscela viene raffreddata, l'eccesso di inneschi specifici per il DNA bersaglio assicura che la maggior parte dei filamenti bersaglio si leghi ad un innesco e non l'un l'altro (Figura b).
(3) Successivamente, viene aggiunta la DNA polimerasi che estende gli inneschi utilizzando come stampo il DNA bersaglio (Figura c).
(4) Dopo un appropriato tempo di incubazione, la miscela viene nuovamente scaldata per separare i due filamenti. La miscela viene quindi raffreddata per permettere agli inneschi di ibridare con le regioni complementari del DNA di nuova sintesi e l'intero processo viene ripetuto (Figura e).
Quindi, ciascun "ciclo" di PCR prevede i seguenti passaggi:
(1) denaturazione mediante calore della doppia elica del DNA bersaglio.
(2) abbassamento della temperatura per permettere l'ibridazione tra gli inneschi specifici e il DNA bersaglio, e
(3)
Si
noti nella Figura come
il prodotto di un ciclo di PCR possa servire come stampo per quello successivo.
L`utilita` della PCR è legata al fatto che ciascun ciclo duplica la quantità
di DNA bersaglio originale. In pratica si utilizzano 20-30 cicli che permettono
un incremento della sequenza bersaglio di 106-109 volte .
Inizialmente la tecnica PCR sfruttava la DNA polimerasi di Escherichia coli che, a causa delle alte temperature necessarie per denaturare la doppia elica del DNA, veniva danneggiata e quindi ad ogni ciclo di reazione era richiesta l'aggiunta di nuova polimerasi. Questo, oltre ad essere molto costoso, tendeva a limitare il numero di cicli che poteva essere effettuato. Il problema è stato risolto con l'impiego di una DNA polimerasi termostabile isolata dal batterio termofilo denominato Thermus aquaticus. La DNA polimerasi dì questo organismo, conosciuta come Taq polimerasi, è stabile a 95 ºC e quindi non risente delle alte temperature impiegate nella PCR per la denaturazione della doppia elica del DNA. L`uso della Taq polimerasi aumenta inoltre la specificità della reazione della PCR perché il DNA viene copiato a 72 ºC e non a 37 ºC. Utilizzando la Taq polimerasi, invece dell'enzima di E. coli, il prodotto della PCR è molto più omogeneo in quanto, alle alte temperature, l'ibridazione degli inneschi con sequenze non specifiche si verifica molto più raramente.
Un problema legato all'utilizzazione della Taq polimerasi è la mancanza di attività esonucleasica per la correzione dei nucleotidi introdotti erroneamente, che determina una possibilità di errore maggiore rispetto all'enzima estratto da E. coli. Attualmente vengono sfruttate per la PCR DNA polimerasi estratte da Archebatteri marini ipertermofili, dotate di attività esonucleasica che controlla e corregge gli errori.
Poiché nella PCR sono necessari diversi passaggi ripetuti, sono stati sviluppati strumenti che possono essere programmati per lo svolgimento automatizzato di cicli di riscaldamento e raffreddamento. Poiché ciascun ciclo richiede mediamente solo cinque minuti, queste procedure automatizzate permettono una notevole amplificazione anche in poche ore (invece, la stessa amplificazione mediante metodi di clonaggio in vivo richiederebbe diversi giorni). Per sopperire alla notevole richiesta, il gene che codifica per la DNA polimerasi termostabile, impiegata nella PCR e nel sequenziamento del DNA, è stato clonato in E. coli e prodotto in grandi quantità; i costi della PCR sono quindi molto diminuiti rispetto a quelli che dovevano essere sostenuti quando la tecnica fu introdotta.
La PCR ha trovato molte applicazioni pratiche; è una tecnica molto utile in quanto:
(1) permette, prima del clonaggio, di amplificare con degli inneschi il gene o i geni di interesse, identificati tramite ibridazione.
(2) La PCR può essere estremamente utile anche per il sequenziamento del DNA in quanto produce grandi quantità di specifiche sequenze di DNA ed aumenta enormemente l'efficienza dei protocolli per il sequenziamento.
(3) La PCR può anche essere utilizzata per produrre grandi quantità di DNA mutato. Se sufficientemente lunghi, inneschi contenenti una o poche basi mutate si appaiano ancora al gene bersaglio permettendo l'amplificazione della mutazione introdotta (questa è una forma di mutagenesi sito-diretta). Il DNA mutato può essere utilizzato per trasformare cellule e generare mutanti.
(4)
Poiché gli inneschi utilizzati
non devono essere perfettamente complementari, la PCR è usata per
studi comparativi o evolutivi per isolare da diversi campioni geni già clonati
(e sequenziati) da un organismo. In questi casi gli inneschi sono
costruiti in modo tale da appaiarsi a regioni del gene che si pensa siano
conservate in diversi organismi. Grazie alla sua sensibilità, la
PCR è stata utilizzata per amplificare e clonare il DNA proveniente da fonti
come resti umani mummificati e persino da campioni di animali e piante estinte.
(5)
La PCR può essere utilizzata anche per
amplificare quantità molto piccole di DNA presenti in un campione.
Usando inneschi appropriati è
possibile individuare una singola cellula batterica in un campione in cui sono
presenti molte altre specie.
(6)
La PCR è stata anche utilizzata per
sviluppare il DNA "fingerprinting”, una potente tecnica che può
permettere l'identificazione di individui o relazioni tra individui a partire da
piccoli campioni del loro DNA.